הטרוגניות של סיבי שריר שלד אנושיים מעבר לשרשרת הכבדה של מיוזין

תודה שביקרתם באתר nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים תמיכת CSS מוגבלת. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסת הדפדפן העדכנית ביותר (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בנוסף, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אתר זה יהיה נקי מסגנונות ו-JavaScript.
שרירי שלד הם רקמה הטרוגנית המורכבת בעיקר ממיופיברילים, אשר בבני אדם מסווגים בדרך כלל לשלושה סוגים: אחד "איטי" (סוג 1) ושניים "מהירים" (סוגים 2A ו-2X). עם זאת, ההטרוגניות בין ובתוך סוגי מיופיברילים מסורתיים נותרה אינה מובנת היטב. יישמנו גישות טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות על 1050 ו-1038 מיופיברילים בודדים מ-Vastus lateralis אנושי, בהתאמה. מחקר הפרוטאומיה כלל גברים, ומחקר הטרנסקריפטומי כלל 10 גברים ו-2 נשים. בנוסף לאיזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין, זיהינו חלבונים מטבוליים, חלבונים ריבוזומליים וחלבונים צומתיים תאיים כמקורות לשונות רב-ממדית בין-מיופיבריליים. יתר על כן, למרות זיהוי אשכולות של סיבים איטיים ומהירים, הנתונים שלנו מצביעים על כך שסיבים מסוג 2X אינם ניתנים להבחנה פנוטיפית מסיבים אחרים בעלי עווית מהירה. יתר על כן, סיווג מבוסס שרשרת כבדה של מיוזין אינו מספיק כדי לתאר את הפנוטיפ של המיופיבים במיופתיה נמלינית. בסך הכל, הנתונים שלנו מצביעים על הטרוגניות רב-ממדית של סיבי שריר, עם מקורות שונות המשתרעים מעבר לאיזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין.
הטרוגניות תאית היא מאפיין אינהרנטי של כל המערכות הביולוגיות, המאפשר לתאים להתמחות כדי לענות על הצרכים השונים של רקמות ותאים.1 התפיסה המסורתית של הטרוגניות של סיבי שריר השלד הייתה שנוירונים מוטוריים מגדירים את סוג הסיב בתוך יחידה מוטורית, וכי סוג הסיב (כלומר, סוג 1, סוג 2A וסוג 2X בבני אדם) נקבע על ידי המאפיינים של האיזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין (MYH).2 זה התבסס בתחילה על חוסר היציבות של ה-pH ATPase שלהם,3,4 ומאוחר יותר על הביטוי המולקולרי שלהם של MYH.5 עם זאת, עם זיהוי וקבלה שלאחר מכן של סיבים "מעורבים" המבטאים יחד MYHs מרובים בפרופורציות משתנות, סיבי שריר השלד נתפסים יותר ויותר כרצף ולא כסוגי סיבים נפרדים.6 למרות זאת, התחום עדיין מסתמך במידה רבה על MYH כמסווג העיקרי לסיווג סיבי שריר, תפיסה שכנראה מושפעת מהמגבלות וההטיות המשמעותיות של מחקרים מוקדמים על מכרסמים שפרופילי הביטוי של MYH וטווח סוגי הסיבים שלהם שונים מאלה שבבני אדם.2 המצב מסתבך עוד יותר בשל העובדה ששרירי שלד אנושיים שונים מציגים מגוון רחב של סוגי סיבים.7 ה- vastus lateralis הוא שריר מעורב עם פרופיל ביטוי MYH בינוני (ולכן מייצג).7 יתר על כן, קלות הדגימה שלו הופכת אותו לשריר הנחקר ביותר בבני אדם.
לפיכך, חקירה אובייקטיבית של גיוון סיבי שריר השלד באמצעות כלי "אומיקס" רבי עוצמה היא קריטית אך גם מאתגרת, בין היתר בשל האופי הרב-גרעיני של סיבי שריר השלד. עם זאת, טכנולוגיות טרנסקריפטומיקה8,9 ופרוטאומיקה10 עברו מהפכה ברגישות בשנים האחרונות עקב התקדמות טכנולוגית שונות, המאפשרת ניתוח של שרירי שלד ברזולוציה של סיב בודד. כתוצאה מכך, חלה התקדמות משמעותית באפיון גיוון של סיב בודד ותגובתם לגירויים אטרופיים ולהזדקנות11,12,13,14,15,16,17,18. חשוב לציין, להתקדמות טכנולוגית זו יש יישומים קליניים, המאפשרים אפיון מפורט ומדויק יותר של הפרעות ויסות הקשורות למחלות. לדוגמה, הפתופיזיולוגיה של מיופתיה נמלינית, אחת ממחלות השריר התורשתיות הנפוצות ביותר (MIM 605355 ו-MIM 161800), היא מורכבת ומבלבלת.19,20 לכן, אפיון טוב יותר של הפרעות ויסות של סיבי שריר השלד יכול להוביל להתקדמות משמעותית בהבנתנו את מחלה זו.
פיתחנו שיטות לניתוח טרנסקריפטומי ופרוטאומי של סיבי שריר שלד בודדים שבודדו ידנית מדגימות ביופסיה אנושיות, ויישמנו אותן על אלפי סיבים, מה שאפשר לנו לחקור את ההטרוגניות התאית של סיבי שריר שלד אנושיים. במהלך עבודה זו, הדגמנו את כוחו של פנוטיפינג טרנסקריפטומי ופרוטאומי של סיבי שריר וזיהינו חלבונים מטבוליים, ריבוזומליים וחלבונים צומתיים תאיים כמקורות משמעותיים לשונות בין-סיבים. יתר על כן, באמצעות תהליך עבודה פרוטאומי זה, אפיינו את הרלוונטיות הקלינית של מיופתיה נמטודית בסיבים שריר שלד בודדים, וחשפנו מעבר מתואם לעבר סיבים לא חמצוניים ללא תלות בסוג הסיב בהתבסס על MyH.
כדי לחקור את ההטרוגניות של סיבי שריר שלד אנושיים, פיתחנו שני זרימות עבודה כדי לאפשר ניתוח טרנסקריפטומים ופרוטאומים של סיבי שריר שלד בודדים (איור 1A ואיור משלים 1A). פיתחנו וייענו מספר שלבים מתודולוגיים, החל מאחסון דגימות ושימור שלמות RNA וחלבון ועד אופטימיזציה של התפוקה עבור כל גישה. עבור ניתוח טרנסקריפטומים, הדבר הושג על ידי הוספת ברקודים מולקולריים ספציפיים לדגימה בשלב הראשוני של שעתוק הפוך, מה שאפשר איגום של 96 סיבים לעיבוד יעיל במורד הזרם. ריצוף עמוק יותר (±1 מיליון קריאות לכל סיב) בהשוואה לגישות מסורתיות של תא בודד העשיר עוד יותר את נתוני הטרנסקריפטומים.21 עבור פרוטאומיקה, השתמשנו בגרדיאנט כרומטוגרפי קצר (21 דקות) בשילוב עם רכישת נתוני DIA-PASEF על ספקטרומטר מסות timsTOF כדי לייעל את עומק הפרוטאום תוך שמירה על תפוקה גבוהה. 22,23 כדי לחקור את ההטרוגניות של סיבי שריר שלד בריאים, אפייננו את הטרנסקריפטומים של 1,050 סיבים בודדים מ-14 תורמים בוגרים בריאים ואת הפרוטאומים של 1,038 סיבים מ-5 תורמים בוגרים בריאים (טבלה משלימה 1). במאמר זה, מערכי נתונים אלה מכונים טרנסקריפטומים ופרוטאומים של 1,000 סיבים, בהתאמה. הגישה שלנו זיהתה סך של 27,237 טרנסקריפטומים ו-2,983 חלבונים בניתוחים הטרנסקריפטומיים והפרוטאומיים של 1,000 סיבים (איור 1א', מערכי נתונים משלימים 1-2). לאחר סינון מערכי הנתונים הטרנסקריפטומיים והפרוטאומיים עבור >1,000 גנים שזוהו ו-50% ערכים תקפים לכל סיב, בוצעו ניתוחי ביואינפורמטיקה נוספים עבור 925 ו-974 סיבים בטרנסקריפטום ובפרוטאום, בהתאמה. לאחר הסינון, זוהו בממוצע 4257 ± 1557 גנים ו-2015 ± 234 חלבונים (ממוצע ± סטיית תקן) לכל סיב, עם שונות מוגבלת בין-אישית (איורים משלימים 1B-C, מערכי נתונים משלימים 3-4). עם זאת, השונות בתוך הנבדקים הייתה בולטת יותר בקרב המשתתפים, ככל הנראה עקב הבדלים בתפוקת RNA/חלבון בין סיבים באורכים שונים ובשטחי חתך שונים. עבור רוב החלבונים (>2000), מקדם השונות היה מתחת ל-20% (איור משלים 1D). שתי השיטות אפשרו לכידת טווח דינמי רחב של תמלילים וחלבונים עם חתימות בעלות ביטוי גבוה החשובות להתכווצות שרירים (למשל, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (איורים משלימים 1E-F). רוב המאפיינים שזוהו היו משותפים בין מערכי הנתונים הטרנסקריפטומיים והפרוטאומיים (איור משלים 1G), ועוצמות ה-UMI/LFQ הממוצעות של מאפיינים אלה היו מתואמות באופן סביר (r = 0.52) (איור משלים 1H).
זרימת עבודה של טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה (נוצר באמצעות BioRender.com). עקומות טווח דינמי של BD עבור MYH7, MYH2 ו-MYH1, וספים מחושבים להקצאת סוג סיבים. E, F התפלגות ביטוי MYH על פני סיבים במערכי נתונים של טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה. G, H תרשימי קירוב והשלכה אחידים של גיוון (UMAP) עבור טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה צבועים לפי סוג סיב מבוסס MYH. I, J תרשימי מאפיינים המציגים את ביטוי MYH7, MYH2 ו-MYH1 במערכי נתונים של טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה.
בתחילה יצאנו להקצות סוג סיב מבוסס MYH לכל סיב באמצעות גישה אופטימלית המנצלת את הרגישות הגבוהה והטווח הדינמי של ביטוי MYH במערכי נתונים של אומיקס. מחקרים קודמים השתמשו בספים שרירותיים כדי לתייג סיבים כסוג 1 טהור, סוג 2A, סוג 2X או מעורבים בהתבסס על אחוז קבוע של ביטוי של MYHs שונים11,14,24. השתמשנו בגישה שונה שבה הביטוי של כל סיב דורג לפי MYHs בהם השתמשנו כדי לסווג את הסיבים: MYH7, MYH2 ו-MYH1, התואמים לסיבים מסוג 1, סוג 2A וסוג 2X, בהתאמה. לאחר מכן חישבנו מתמטית את נקודת המפנה התחתונה של כל עקומה שהתקבלה והשתמשנו בה כסף כדי להקצות סיבים כחיוביים (מעל הסף) או שליליים (מתחת לסף) עבור כל MYH (איור 1B-D). נתונים אלה מראים כי ל-MYH7 (איור 1B) ול-MYH2 (איור 1C) יש פרופילי ביטוי פעילים/כבויים ברורים יותר ברמת ה-RNA בהשוואה לרמת החלבון. ואכן, ברמת החלבון, מעט מאוד סיבים לא ביטאו MYH7, ולאף סיב לא היה ביטוי של 100% של MYH2. לאחר מכן השתמשנו בספי ביטוי שנקבעו מראש כדי להקצות סוגי סיבים מבוססי MYH לכל הסיבים בכל מערך נתונים. לדוגמה, סיבים מבוססי MYH7+/MYH2-/MYH1- שויכו לסוג 1, בעוד שסיבים מסוג MYH7-/MYH2+/MYH1+ שויכו לסוג מעורב 2A/2X (ראה טבלה משלימה 2 לתיאור מלא). באיסוף כל הסיבים, צפינו בהתפלגות דומה להפליא של סוגי סיבים מבוססי MYH הן ברמות ה-RNA (איור 1E) והן ברמות החלבון (איור 1F), בעוד שההרכב היחסי של סוגי סיבים מבוססי MYH השתנה בין פרטים, כצפוי (איור משלים 2A). רוב הסיבים סווגו כסוג 1 טהור (34-35%) או סוג 2A (36-38%), אם כי זוהה גם מספר משמעותי של סיבים מעורבים מסוג 2A/2X (16-19%). הבדל בולט הוא שניתן היה לזהות סיבים טהורים מסוג 2X רק ברמת ה-RNA, אך לא ברמת החלבון, דבר המצביע על כך שביטוי מהיר של MYH מווסת לפחות באופן חלקי לאחר התעתוק.
אימתנו את שיטת ההקלדה של סיבי MYH המבוססת על פרוטאומיקה באמצעות נקודה סופחת מבוססת נוגדנים, ושתי השיטות השיגו התאמה של 100% בזיהוי סיבים טהורים מסוג 1 וסוג 2A (ראה איור משלים 2B). עם זאת, הגישה המבוססת על פרוטאומיקה הייתה רגישה יותר, יעילה יותר בזיהוי סיבים מעורבים, וכימות הפרופורציה של כל גן MYH בכל סיב. נתונים אלה מדגימים את היעילות של שימוש בגישה אובייקטיבית ורגישה ביותר המבוססת על אומיקס לאפיון סוגי סיבי שריר שלד.
לאחר מכן השתמשנו במידע המשולב שסופק על ידי טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה כדי לסווג באופן אובייקטיבי את שרירי הגוף על סמך הטרנסקריפטום או הפרוטאום המלאים שלהם. באמצעות שיטת קירוב והשלכה אחידה של סעפת אחידה (UMAP) כדי להפחית את המימדיות לשישה מרכיבים עיקריים (איורים משלימים 3A-B), הצלחנו לדמיין את השונות של שרירי הגוף בטרנסקריפטום (איור 1G) ובפרוטאום (איור 1H). ראוי לציין כי שרירי הגוף לא קובצו לפי משתתפים (איורים משלימים 3C-D) או ימי בדיקה (איור משלים 3E) במערכי הנתונים של טרנסקריפטומיקה או פרוטאומיקה, דבר המצביע על כך שהשונות בתוך נבדקים בסיבים של שרירי השלד גבוהה יותר מהשונות בין נבדקים. בגרף UMAP, הופיעו שני אשכולות נפרדים המייצגים שרירי גוף "מהירים" ו"איטים" (איורים 1G-H). סיבי שריר MYH7+ (איטיים) היו מקובצים בקוטב החיובי של UMAP1, בעוד שמיורי MYH2+ ו-MYH1+ (מהירים) היו מקובצים בקוטב השלילי של UMAP1 (איורים 1I-J). עם זאת, לא נעשתה הבחנה בין סוגי סיבים בעלי עווית מהירה (כלומר, סוג 2A, סוג 2X, או 2A/2X מעורב) בהתבסס על ביטוי MYH, דבר המצביע על כך שביטוי MYH1 (איור 1I-J) או סמני שריר 2X קלאסיים אחרים כמו ACTN3 או MYLK2 (איורים משלימים 4A-B) אינו מבדיל בין סוגי שרירים שונים כאשר בוחנים את הטרנסקריפטום או הפרוטאום כולו. יתר על כן, בהשוואה ל-MYH2 ו-MYH7, מעט טרנסקריפטים או חלבונים היו בקורלציה חיובית עם MYH1 (איורים משלימים 4C-H), דבר המצביע על כך ששפע MYH1 אינו משקף באופן מלא את הטרנסקריפטום/פרוטאום של סיבי שריר. מסקנות דומות הושגו בעת הערכת הביטוי המעורב של שלושת האיזופורמים של MYH ברמת UMAP (איורים משלימים 4I-J). לפיכך, בעוד שניתן לזהות סיבי 2X ברמת התעתיק על סמך כימות MYH בלבד, סיבי MYH1+ אינם ניתנים להבחנה מסיבים מהירים אחרים כאשר בוחנים את הטרנסקריפטום או הפרוטאום כולו.
כבדיקה ראשונית של הטרוגניות של סיבים איטיים מעבר ל-MYH, הערכנו ארבעה חלבונים ספציפיים לסוג סיבים איטיים: TPM3, TNNT1, MYL3 ו-ATP2A22. תת-סוגים של סיבים איטיים הראו קורלציות גבוהות, אם כי לא מושלמות, של פירסון עם MYH7 הן בטרנסקריפטומיקה (איור משלים 5A) והן בפרוטאומיקה (איור משלים 5B). כ-25% ו-33% מהסיבים האיטיים לא סווגו כסיבים איטיים טהורים על ידי כל תת-סוגי הגנים/חלבונים בטרנסקריפטומיקה (איור משלים 5C) ובפרוטאומיקה (איור משלים 5D), בהתאמה. לכן, סיווג סיבים איטיים המבוסס על תת-סוגים מרובים של גנים/חלבונים מציג מורכבות נוספת, אפילו עבור חלבונים הידועים כספציפיים לסוג סיבים. ממצא זה מצביע על כך שסיווג סיבים המבוסס על איזופורמים של משפחת גנים/חלבונים בודדת עשוי לא לשקף כראוי את ההטרוגניות האמיתית של סיבי שריר השלד.
כדי לחקור עוד יותר את השונות הפנוטיפית של סיבי שריר שלד אנושיים בקנה מידה של מודל האומיקס כולו, ביצענו הפחתה ממדית בלתי מוטה של ​​הנתונים באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) (איור 2A). בדומה לתרשימי UMAP, לא המשתתף ולא יום הבדיקה השפיעו על צבירת הסיבים ברמת PCA (איורים משלימים 6A-C). בשני מערכי הנתונים, סוג הסיבים מבוססי MYH הוסבר על ידי PC2, שהראה אשכול של סיבים מסוג 1 בעלי עווית איטית ואשכול שני המכיל סיבים מסוג 2A, סוג 2X וסיבים מעורבים מסוג 2A/2X בעלי עווית מהירה (איור 2A). בשני מערכי הנתונים, שני האשכולות הללו היו מחוברים על ידי מספר קטן של סיבים מעורבים מסוג 1/2A. כצפוי, ניתוח ייצוג יתר של גורמי ה-PC העיקריים אישר ש-PC2 הונע על ידי חתימות התכווצות ומטבוליות (איור 2B ואיורים משלימים 6D-E, מערכי נתונים משלימים 5-6). בסך הכל, סוג סיבים מבוססי MYH נמצא מספיק כדי להסביר שונות רציפה לאורך PC2, למעט סיבים כביכול 2X שהיו מפוזרים ברחבי הטרנסקריפטום בתוך האשכול המהיר.
א. עלילות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של מערכי נתונים של טרנסקריפטומים ופרוטאומים, צבועות לפי סוג סיב על סמך MYH. ב. ניתוח העשרה של מניעי טרנסקריפט וחלבון ב-PC2 ו-PC1. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות חבילת clusterProfiler וערכי p מותאמים לפי בנג'מיני-הוכברג. ג, ד. עלילות PCA צבועות לפי מונחי אונטולוגיה של גן הידבקות בין-תאי (GO) במונחי ה-GO של הטרנסקריפטום והקוסטמרים בפרוטאום. חצים מייצגים מניעי טרנסקריפט וחלבון וכיוונים שלהם. ה, ו. עלילות קירוב והשלכה אחידים של סעפת (UMAP) של מאפיינים רלוונטיים קלינית המציגים גרדיאנטים של ביטוי ללא תלות בסוג סיב איטי/מהיר. ז, ח. קורלציות בין מניעי PC2 ו-PC1 בטרנסקריפטומים ובפרוטאומים.
באופן בלתי צפוי, סוג שרירי השלד מבוסס MYH הסביר רק את דרגת השונות השנייה בגודלה (PC2), דבר המצביע על כך שגורמים ביולוגיים אחרים שאינם קשורים לסוג שרירי השלד מבוסס MYH (PC1) ממלאים תפקיד חשוב בוויסות ההטרוגניות של סיבי שריר השלד. ניתוח ייצוג יתר של הגורמים המובילים ב-PC1 גילה כי השונות ב-PC1 נקבעה בעיקר על ידי הידבקות תא-תא ותכולת הריבוזום בטרנסקריפטום, וקוסטמרים וחלבונים ריבוזומליים בפרוטאום (איור 2B ואיורים משלימים 6D-E, מערך נתונים משלים 7). בשרירי השלד, קוסטמרים מחברים את דיסק ה-Z לסרקולמה ומעורבים בהעברת כוח ובסיגנל. 25 תרשימי PCA מבוארים המשתמשים בתכונות הידבקות תא-תא (טרנסקריפטום, איור 2C) וקוסטמרים (פרוטאום, איור 2D) גילו הסטה חזקה שמאלה ב-PC1, דבר המצביע על כך שתכונות אלו מועשרות בסיבים מסוימים.
בחינה מפורטת יותר של אשכולות סיבי שריר ברמת UMAP גילתה שרוב המאפיינים הציגו גרדיאנט ביטוי מבוסס MYH שאינו תלוי בסוג סיבי שריר ולא ספציפי לתת-אשכול סיבי שריר. המשכיות זו נצפתה עבור מספר גנים הקשורים למצבים פתולוגיים (איור 2E), כגון CHCHD10 (מחלת עצבית-שרירים), SLIT3 (ניוון שרירים), CTDNEP1 (מחלת שרירים). המשכיות זו נצפתה גם על פני הפרוטאום, כולל חלבונים הקשורים להפרעות נוירולוגיות (UGDH), איתות אינסולין (PHIP) ותעתוק (HIST1H2AB) (איור 2F). יחד, נתונים אלה מצביעים על המשכיות בהטרוגניות של עוויתות איטיות/מהירות שאינה תלויה בסוג סיבי שריר על פני סיבי שריר שונים.
מעניין לציין, שגנים של מניעים ב-PC2 הראו מתאם טוב בין טרנסקריפטום לפרוטאום (r = 0.663) (איור 2G), דבר המצביע על כך שסוגי סיבים בעלי עווית איטית ומהירה, ובפרט התכונות הכיווץ והמטבוליות של סיבי שריר השלד, מווסתים באופן תעתוקי. עם זאת, גנים של מניעים ב-PC1 לא הראו מתאם בין טרנסקריפטום לפרוטאום (r = -0.027) (איור 2H), דבר המצביע על כך ששונות שאינה קשורה לסוגי סיבים בעלי עווית איטית/מהירה מווסתת במידה רבה לאחר התעתוק. מכיוון ששונות ב-PC1 הוסברו בעיקר על ידי מונחים אונטולוגיים של גנים ריבוזומליים, ובהינתן שריבוזומים ממלאים תפקיד מכריע ומיוחד בתא על ידי השתתפות פעילה והשפעה על תרגום חלבונים,31 יצאנו לאחר מכן לחקור את ההטרוגניות הבלתי צפויה הזו של הריבוזומלית.
תחילה צבענו את עלילת ניתוח הרכיבים העיקריים של פרוטאומיקה בהתאם לשפע היחסי של חלבונים במונח GOCC "ריבוזום ציטופלזמי" (איור 3A). למרות שמונח זה מועשר בצד החיובי של PC1, וכתוצאה מכך נוצר גרדיאנט קטן, חלבונים ריבוזומליים מניעים את החלוקה בשני הכיוונים של PC1 (איור 3A). חלבונים ריבוזומליים מועשרים בצד השלילי של PC1 כללו RPL18, RPS18 ו-RPS13 (איור 3B), בעוד ש-RPL31, RPL35 ו-RPL38 (איור 3C) היו המניעים העיקריים בצד החיובי של PC1. מעניין לציין, ש-RPL38 ו-RPS13 באו לידי ביטוי גבוה בשרירי שלד בהשוואה לרקמות אחרות (איור משלים 7A). חתימות ריבוזומליות ייחודיות אלו ב-PC1 לא נצפו בטרנסקריפטום (איור משלים 7B), דבר המצביע על ויסות פוסט-טרנסקריפטומי.
א. עלילת ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) צבועה לפי מונחי אונטולוגיה של גנים ריבוזומליים ציטופלזמיים (GO) על פני הפרוטאום. חצים מצביעים על כיוון השונות בתיווך החלבון בעלילת PCA. אורך הקו מתאים לציון הרכיבים העיקריים עבור חלבון נתון. ב, ג. עלילות מאפייני PCA עבור RPS13 ו-RPL38. ד. ניתוח אשכול היררכי לא מפוקח של חלבונים ריבוזומליים ציטופלזמיים. ה. מודל מבני של הריבוזום 80S (PDB: 4V6X) המדגיש חלבונים ריבוזומליים עם שכיחות שונה בסיבים של שריר השלד. ו. חלבונים ריבוזומליים עם סטוכיומטריה שונה הממוקמים ליד תעלת היציאה של mRNA.
המושגים של הטרוגניות והתמחות ריבוזומלית הוצעו בעבר, לפיהם נוכחות של תת-אוכלוסיות שונות של ריבוזומים (הטרוגניות ריבוזומלית) יכולה להשפיע ישירות על תרגום חלבונים ברקמות שונות32 ותאים33 באמצעות תרגום סלקטיבי של מאגרי תעתיק mRNA ספציפיים34 (התמחות ריבוזומים). כדי לזהות תת-אוכלוסיות של חלבונים ריבוזומליים המתבטאים יחד בסיבים של שרירי השלד, ביצענו ניתוח אשכול היררכי לא מפוקח של חלבונים ריבוזומליים בפרוטאום (איור 3D, מערך נתונים משלים 8). כצפוי, חלבונים ריבוזומליים לא התקבצו לפי סוג סיב בהתבסס על MYH. עם זאת, זיהינו שלושה אשכולות שונים של חלבונים ריבוזומליים; האשכול הראשון (ribosomal_cluster_1) מווסת יחד עם RPL38 ולכן יש לו ביטוי מוגבר בסיבים עם פרופיל PC1 חיובי. האשכול השני (ribosomal_cluster_2) מווסת יחד עם RPS13 והוא מוגבר בסיבים עם פרופיל PC1 שלילי. האשכול השלישי (ribosomal_cluster_3) אינו מראה ביטוי דיפרנציאלי מתואם בסיבים של שריר השלד וניתן להתייחס אליו כאל חלבון הריבוזומלי "הליבה" של שריר השלד. שני האשכולות הריבוזומליים 1 ו-2 מכילים חלבונים ריבוזומליים שהוכחו בעבר כמבקרים תרגום חלופי (למשל, RPL10A, RPL38, RPS19 ו-RPS25) ומשפיעים פונקציונלית על ההתפתחות (למשל, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 בהתאם לתוצאות ה-PCA, הייצוג ההטרוגני שנצפה של חלבונים ריבוזומליים אלה על פני הסיבים הראה גם הוא המשכיות (איור משלים 7C).
כדי להמחיש את מיקומם של חלבונים ריבוזומליים הטרוגניים בתוך הריבוזום, השתמשנו במודל מבני של הריבוזום האנושי 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (איור 3E). לאחר בידוד חלבונים ריבוזומליים השייכים לאשכולות ריבוזומליים שונים, מיקומם לא היה מיושר באופן הדוק, דבר המצביע על כך שהגישה שלנו לא הצליחה לספק העשרה לאזורים/שברים מסוימים של הריבוזום. מעניין לציין, עם זאת, ששיעור החלבונים בתת-היחידות הגדולות באשכול 2 היה נמוך יותר מאשר באשכולות 1 ו-3 (איור משלים 7D). צפינו שחלבונים עם סטוכיומטריה שונה בסיבים של שריר השלד היו ממוקמים בעיקר על פני השטח של הריבוזום (איור 3E), דבר התואם את יכולתם לתקשר עם אלמנטים של אתר כניסה פנימי לריבוזום (IRES) באוכלוסיות mRNA שונות, ובכך לתאם תרגום סלקטיבי. 40, 41 יתר על כן, חלבונים רבים עם סטוכיומטריה שונה בסיבים של שריר השלד היו ממוקמים ליד אזורים פונקציונליים כמו מנהרת היציאה של mRNA (איור 3F), אשר מווסתים באופן סלקטיבי התארכות תרגוםית ועצירה של פפטידים ספציפיים. 42 לסיכום, הנתונים שלנו מצביעים על כך שהסטוכיומטריה של חלבוני ריבוזומליים של שרירי השלד מציגה הטרוגניות, וכתוצאה מכך נוצרים הבדלים בין סיבי שריר השלד.
לאחר מכן יצאנו לזהות חתימות של סיבים בעלי עווית מהירה ואיטית ולחקור את מנגנוני הוויסות התעתוקי שלהם. בהשוואה בין אשכולות הסיבים בעלי עווית מהירה ואיטית שהוגדרו על ידי UMAP בשני מערכי הנתונים (איורים 1G-H ו-4A-B), ניתוחים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים זיהו 1366 ו-804 מאפיינים בעלי שפע דיפרנציאלי, בהתאמה (איורים 4A-B, מערכי נתונים משלימים 9-12). צפינו בהבדלים הצפויים בחתימות הקשורות לסרקומרים (למשל, טרופומיוזין וטרופונין), צימוד עירור-התכווצות (איזופורמים של SERCA) ומטבוליזם אנרגטי (למשל, ALDOA ו-CKB). יתר על כן, טרנסקריפטים וחלבונים המווסתים יוביקוויטינציה של חלבונים באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בסיבים בעלי עווית מהירה ואיטית (למשל, USP54, SH3RF2, USP28 ו-USP48) (איורים 4A-B). יתר על כן, גן החלבון המיקרוביאלי RP11-451G4.2 (DWORF), אשר הוכח בעבר כמתבטא באופן דיפרנציאלי בין סוגי סיבי שריר טלה43 ומשפר את פעילות SERCA בשריר הלב44, היה מווסת באופן משמעותי כלפי מעלה בסיבים איטיים של שרירי שלד (איור 4A). באופן דומה, ברמת הסיב האינדיבידואלי, נצפו הבדלים משמעותיים בחתימות ידועות כגון איזופורמים של לקטט דהידרוגנאז הקשורים למטבוליזם (LDHA ו-LDHB, איור 4C ואיור משלים 8A)45,46 וכן בחתימות ספציפיות לסוג סיב שלא היו ידועות קודם לכן (כגון IRX3, USP54, USP28 ו-DPYSL3) (איור 4C). הייתה חפיפה משמעותית של מאפיינים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין מערכי הנתונים הטרנסקריפטומיים והפרוטאומיים (איור משלים 8B), כמו גם מתאם של שינוי קיפול המונע בעיקר על ידי ביטוי דיפרנציאלי בולט יותר של מאפייני סרקומרים (איור משלים 8C). ראוי לציין, כי חלק מהחתימות (למשל USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) הראו בקרה פוסט-תעתוק חזקה רק ברמה הפרוטאומית והיו להן פרופילי ביטוי ספציפיים לסוג סיבים מסוג עווית איטי/מהיר (איור משלים 8C).
תרשימי הרי געש A ו-B המשווים אשכולות איטיים ומהירים שזוהו על ידי תרשימי קירוב והשלכה אחידים של סעפת (UMAP) באיורים 1G-H. נקודות צבעוניות מייצגות תמלילים או חלבונים השונים באופן משמעותי ב-FDR < 0.05, ונקודות כהות יותר מייצגות תמלילים או חלבונים השונים באופן משמעותי בשינוי לוגריתמי > 1. ניתוח סטטיסטי דו-כיווני בוצע באמצעות מבחן DESeq2 Wald עם ערכי p מותאמים ל-Benjamini-Hochberg (טרנסקריפטומיקה) או שיטת המודל הליניארי Limma עם ניתוח בייסיאני אמפירי ולאחר מכן התאמת Benjamini-Hochberg להשוואות מרובות (פרוטאומיקה). C תרשימי חתימה של גנים או חלבונים שנבחרו עם ביטוי דיפרנציאלי בין סיבים איטיים ומהירים. D ניתוח העשרה של תמלילים וחלבונים עם ביטוי דיפרנציאלי משמעותי. ערכים חופפים מועשרים בשני מערכי הנתונים, ערכי טרנסקריפטום מועשרים רק בטרנסקריפטום, וערכי פרוטאום מועשרים רק בפרוטאום. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות חבילת clusterProfiler עם ערכי p מותאמים ל-Benjamini-Hochberg. ה. גורמי שעתוק ספציפיים לסוג סיבים שזוהו על ידי SCENIC בהתבסס על ציוני ספציפיות של הרגולטור שמקורם ב-SCENIC וביטוי mRNA דיפרנציאלי בין סוגי סיבים. ו. פרופיל של גורמי שעתוק נבחרים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין סיבים איטיים ומהירים.
לאחר מכן ביצענו ניתוח ייצוג יתר של גנים וחלבונים המיוצגים באופן דיפרנציאלי (איור 4D, מערך נתונים משלים 13). העשרת מסלולים עבור מאפיינים שהיו שונים בין שני מערכי הנתונים חשפה הבדלים צפויים, כגון חמצון β של חומצות שומן ותהליכי מטבוליזם של קטונים (סיבים איטיים), התכווצות שרירים/שרירים (סיבים מהירים ואיטיים, בהתאמה), ותהליכים קטבוליים של פחמימות (סיבים מהירים). פעילות פוספטאז חלבון סרין/תראונין הייתה גם מוגברת בסיבים מהירים, מונע על ידי מאפיינים כגון תת-היחידות פוספטאז רגולטוריות וקטליטיות (PPP3CB, PPP1R3D ו-PPP1R3A), הידועות כמבקרות את מטבוליזם הגליקוגן (47) (איורים משלימים 8D-E). מסלולים נוספים שהועשרו בסיבים מהירים כללו גופי עיבוד (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) בפרוטאום (איור משלים 8F), אשר עשויים להיות מעורבים בוויסות פוסט-טרנסקריפטומי (48), ובפעילות גורמי שעתוק (SREBF1, RXRG, RORA) בטרנסקריפטום (איור משלים 8G). סיבים איטיים הועשרו בפעילות אוקסידורדוקטאז (BDH1, DCXR, TXN2) (איור משלים 8H), קישור אמיד (CPTP, PFDN2, CRYAB) (איור משלים 8I), מטריצה ​​חוץ-תאית (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (איור משלים 8J), ופעילות קולטן-ליגנד (FNDC5, SPX, NENF) (איור משלים 8K).
כדי לקבל תובנות נוספות לגבי הרגולציה התעתוקית העומדת בבסיס מאפייני סוג סיבי שריר איטיים/מהירים, ביצענו ניתוח העשרה של גורמי שעתוק באמצעות SCENIC49 (מערך נתונים משלים 14). גורמי שעתוק רבים נמצאו מועשרים באופן משמעותי בין סיבי שריר מהירים לאיטיים (איור 4E). אלה כללו גורמי שעתוק כגון MAFA, אשר נקשר בעבר להתפתחות מהירה של סיבי שריר,50 וכן מספר גורמי שעתוק שלא נקשרו בעבר לתוכניות גנים ספציפיות לסוג סיבי שריר. מבין אלה, PITX1, EGR1 ו-MYF6 היו גורמי השעתוק המועשרים ביותר בסיבים מהירים (איור 4E). לעומת זאת, ZSCAN30 ו-EPAS1 (הידועים גם בשם HIF2A) היו גורמי השעתוק המועשרים ביותר בסיבים איטיים (איור 4E). בהתאם לכך, MAFA בא לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר באזור UMAP המתאים לסיבים מהירים, בעוד של-EPAS1 היה דפוס ביטוי הפוך (איור 4F).
בנוסף לגנים ידועים המקודדים חלבונים, ישנם מספר ביוטיפים של RNA שאינם מקודדים שעשויים להיות מעורבים בוויסות ההתפתחות והמחלות האנושיות. 51, 52 במערכי נתונים של טרנסקריפטומים, מספר RNA שאינם מקודדים מציגים ספציפיות לסוג סיבים (איור 5A ומערך נתונים משלים 15), כולל LINC01405, שהוא ספציפי מאוד לסיבים איטיים ודווחו כי הוא מופחת בשרירים של חולים עם מיופתיה מיטוכונדריאלית. 53 לעומת זאת, RP11-255P5.3, התואם לגן lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, מציג ספציפיות לסוג סיבים מהירים. גם LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) וגם RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) מפגינים ספציפיות לשרירי שלד (איורים משלימים 9A-B) ואין להם גנים מתכווצים ידועים בסביבתם הגנומית של 1 מגה-בייט, דבר המצביע על כך שהם ממלאים תפקיד מיוחד בוויסות סוגי סיבים ולא בוויסות גנים מתכווצים שכנים. פרופילי הביטוי הספציפיים לסוג סיבים איטי/מהיר של LINC01405 ו-RP11-255P5.3, בהתאמה, אושרו באמצעות RNAscope (איורים 5B-C).
א. תמלילי RNA לא מקודד מווסתים באופן משמעותי בסיבים בעלי עווית איטית ומהירה. ב. תמונות RNAscope מייצגות המציגות את הספציפיות לסוג סיבים בעלי עווית איטית ומהירה של LINC01405 ו-RP11-255P5.3, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. ג. כימות ביטוי RNA לא מקודד ספציפי לסוג סיבים שריריים כפי שנקבע על ידי RNAscope (n = 3 ביופסיות מפרטים בלתי תלויים, המשווים סיבי שריר מהירים ואיטיים בתוך כל פרט). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t דו-צדדי של סטודנט. תרשימי קופסה מציגים את החציון ואת הרבעונים הראשון והשלישי, כאשר הזיקית מצביעה על הערכים המינימליים והמקסימליים. ד. זרימת עבודה לזיהוי חלבונים מיקרוביאליים de novo (נוצרה באמצעות BioRender.com). ה. החלבון המיקרוביאלי LINC01405_ORF408:17441:17358 מתבטא באופן ספציפי בסיבים איטיים של שריר השלד (n=5 ביופסיות ממשתתפים בלתי תלויים, המשווים סיבי שריר מהירים ואיטיים בכל משתתף). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות שיטת המודל הליניארי של לים בשילוב עם גישה בייסיאנית אמפירית, ולאחר מכן שיטת בנג'מיני-הוכברג להשוואות מרובות עם התאמת ערך p. תרשימי הקופסאות מציגים את החציון, הרבעונים הראשון והשלישי, כאשר הוויסקיים מצביעים על ערכי המקסימום/מינימום.
לאחרונה, מחקרים הראו כי תמלילים רבים שאינם מקודדים לכאורה מקודדים חלבונים מיקרוביאליים משועתקים, שחלקם מווסתים את תפקוד השרירים. 44, 55 כדי לזהות חלבונים מיקרוביאליים בעלי ספציפיות פוטנציאלית לסוג סיבים, חיפשנו במערך הנתונים שלנו של 1000 פרוטאומים באמצעות קובץ FASTA מותאם אישית המכיל את רצפי התמלילים הלא מקודדים (n = 305) שנמצאו במערך הנתונים של 1000 טרנסקריפטומים (איור 5D). זיהינו 197 חלבונים מיקרוביאליים מ-22 תמלילים שונים, 71 מהם היו מווסתים באופן דיפרנציאלי בין סיבי שריר שלד איטיים ומהירים (איור משלים 9C ומערך נתונים משלים 16). עבור LINC01405, זוהו שלושה תוצרי חלבון מיקרוביאליים, שאחד מהם הראה ספציפיות דומה לסיבים איטיים לתמליל שלו (איור 5E ואיור משלים 9D). לפיכך, זיהינו את LINC01405 כגן המקודד חלבון מיקרוביאלי ספציפי לסיבים איטיים של שריר שלד.
פיתחנו תהליך עבודה מקיף לאפיון פרוטאומי בקנה מידה גדול של סיבי שריר בודדים וזיהינו ווסתים של הטרוגניות סיבים במצבים בריאים. יישמנו תהליך עבודה זה כדי להבין כיצד מיופתיות נמליניות משפיעות על ההטרוגניות של סיבי שריר השלד. מיופתיות נמליניות הן מחלות שריר תורשתיות הגורמות לחולשת שרירים, ובילדים שנפגעו ממנה, מציגות מגוון סיבוכים, כולל מצוקה נשימתית, עקמת וניידות גפיים מוגבלת.19,20 בדרך כלל, במיופתיות נמליניות, וריאנטים פתוגניים בגנים כמו אקטין אלפא 1 (ACTA1) גורמים לשכיחות של הרכב סיבי שריר בעלי עווית איטית, אם כי השפעה זו היא הטרוגנית. יוצא מן הכלל בולט אחד הוא מיופתיה נמלינית טרופונין T1 (TNNT1), אשר יש לה דומיננטיות של סיבים מהירים. לפיכך, הבנה טובה יותר של ההטרוגניות העומדת בבסיס חוסר הוויסות של סיבי שריר השלד שנצפתה במיופתיות נמליניות עשויה לסייע בפענוח הקשר המורכב בין מחלות אלו לסוג הסיבי שריר.
בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה (n=3 לכל קבוצה), סיבי שריר שבודדו מחולי מיופתיה נמלינית עם מוטציות בגנים ACTA1 ו-TNNT1 הראו ניוון או דיסטרופיה ניכרת של סיבי שריר (איור 6A, טבלה משלימה 3). מצב זה הציב אתגרים טכניים משמעותיים לניתוח פרוטאומי עקב כמות החומר המוגבלת הזמין. למרות זאת, הצלחנו לזהות 2485 חלבונים ב-272 סיבי שריר שלדיים. לאחר סינון של לפחות 1000 חלבונים כמותיים לכל סיב, 250 סיבים עברו ניתוח ביואינפורמטיקה נוסף. לאחר הסינון, ממוצע של 1573 ± 359 חלבונים לכל סיב נמדדו (איור משלים 10A, מערכי נתונים משלימים 17-18). ראוי לציין, שלמרות ההפחתה המשמעותית בגודל הסיבים, עומק הפרוטאום של דגימות חולי מיופתיה נמלינית הופחת רק במעט. יתר על כן, עיבוד נתונים אלה באמצעות קבצי FASTA שלנו (כולל תמלילים שאינם מקודדים) אפשר לנו לזהות חמישה חלבונים מיקרוביאליים בסיבי שריר שלד מחולי מיופתיה נמלינית (מערך נתונים משלים 19). הטווח הדינמי של הפרוטאום היה רחב משמעותית, וסך החלבונים בקבוצת הביקורת תאם היטב עם תוצאות ניתוח פרוטאומים קודם של 1000 סיבים (איור משלים 10B-C).
א. תמונות מיקרוסקופיות המציגות ניוון או ניוון סיבים ואת הדומיננטיות של סוגי סיבים שונים בהתבסס על MYH במיאופתיה נמלינית ACTA1 ו-TNNT1 (NM). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. כדי להבטיח שחזור של צביעה בחולי ACTA1 ו-TNNT1, שלוש ביופסיות של חולים נצבעו פעמיים עד שלוש (ארבעה חתכים לכל מקרה) לפני בחירת תמונות מייצגות. ב. פרופורציות סוג סיבים במשתתפים בהתבסס על MYH. ג. עלילת ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של סיבי שריר שלד בחולים עם מיופתיה נמלינית ובקבוצת ביקורת. ד. סיבי שריר שלד מחולים עם מיופתיה נמלינית ובקבוצת ביקורת מוקרנים על גבי עלילת PCA שנקבעה מ-1000 הסיבים שנותחו באיור 2. לדוגמה, עלילות געשיות המשוות הבדלים בין משתתפים עם מיופתיה נמלינית ACTA1 ו-TNNT1 לבין קבוצת ביקורת, ובין משתתפים עם מיופתיה נמלינית ACTA1 ו-TNNT1. עיגולים צבעוניים מציינים חלבונים שהיו שונים באופן מובהק ב-π < 0.05, ונקודות כהות מציינות חלבונים שהיו שונים באופן מובהק ב-FDR < 0.05. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות שיטת המודל הליניארי של לימה ושיטות בייסיאניות אמפיריות, ולאחר מכן התאמת ערך p להשוואות מרובות באמצעות שיטת בנג'מיני-הוכברג. H. ניתוח העשרה של חלבונים בעלי ביטוי דיפרנציאלי מובהק על פני כל הפרוטאום ובסיבים מסוג 1 ו-2A. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות חבילת clusterProfiler וערכי p מותאמים על ידי בנג'מיני-הוכברג. I, J. עלילות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) צבועות לפי מונחי מטריצה ​​חוץ-תאית ואונטולוגיה של גנים מיטוכונדריאליים (GO).
מכיוון שמיאופתיה נמלינית יכולה להשפיע על שיעור סוגי המיופתיה המבטאים MYH בשרירי שלד,19,20 בדקנו תחילה את סוגי המיופתיה המבטאים MYH בחולים עם מיופתיה נמלינית ובקבוצת ביקורת. קבענו את סוג המיופתיה באמצעות שיטה אובייקטיבית שתוארה קודם לכן עבור מבחן 1000 המיופתיה (איורים משלימים 10D-E) ושוב לא הצלחנו לזהות מיופתיה טהורה 2X (איור 6B). צפינו בהשפעה הטרוגנית של מיאופתיה נמלינית על סוג המיופתיה, שכן לשני חולים עם מוטציות ACTA1 היה שיעור מוגבר של מיופתיה מסוג 1, בעוד ששני חולים עם מיופתיה נמלינית TNNT1 היה שיעור מופחת של מיופתיה מסוג 1 (איור 6B). ואכן, הביטוי של MYH2 ואיזופורמים מהירים של טרופונין (TNNC2, TNNI2 ו-TNNT3) ירד במיופתיה מסוג ACTA1-nemaline, בעוד שביטוי MYH7 ירד במיופתיה מסוג TNNT1-nemaline (איור משלים 11A). ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על החלפת סוגים הטרוגניים של סיבי שריר במיופתיה מסוג נמלי.19,20 אישרנו תוצאות אלו באמצעות אימונוהיסטוכימיה ומצאנו כי בחולים עם מיופתיה מסוג ACTA1-nemaline הייתה דומיננטיות של סיבי שריר מסוג 1, בעוד שחולים עם מיופתיה מסוג TNNT1-nemaline הראו דפוס הפוך (איור 6A).
ברמת הפרוטאום של הסיב הבודד, סיבי שריר השלד מחולי מיופתיה נמלינית ACTA1 ו-TNNT1 התרכזו עם רוב סיבי הביקורת, כאשר סיבי מיופתיה נמלינית TNNT1 היו בדרך כלל הנפגעים ביותר (איור 6C). זה היה ניכר במיוחד בעת שרטוט עלילות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של סיבים מדומה מנופחים עבור כל מטופל, כאשר חולי מיופתיה נמלינית TNNT1 2 ו-3 נראו הרחוקים ביותר מדגימות הביקורת (איור משלים 11B, מערך נתונים משלים 20). כדי להבין טוב יותר כיצד סיבים מחולי מיופתיה משתווים לסיבים בריאים, השתמשנו במידע מפורט שהתקבל מניתוח פרוטאומי של 1,000 סיבים ממשתתפים בוגרים בריאים. השלכנו סיבים ממערך הנתונים של המיופתיה (חולי מיופתיה נמלינית ACTA1 ו-TNNT1 וקבוצת הביקורת) על גבי עלילת PCA שהתקבלה מניתוח פרוטאומי של 1000 סיבים (איור 6D). פיזור סוגי סיבי MYH לאורך PC2 בסיבים בקבוצת הביקורת היה דומה לפיזור הסיבים שהתקבלה מניתוח פרוטאומי של 1000 סיבים. עם זאת, רוב הסיבים בחולי מיופתיה נמלינית עברו כלפי מטה ב-PC2, וחפפו לסיבים בריאים בעלי עווית מהירה, ללא קשר לסוג סיב MYH המקורי שלהם. לכן, למרות שחולים עם מיופתיה נמלינית ACTA1 הראו הסטה לכיוון סיבים מסוג 1 כאשר כימתו באמצעות שיטות מבוססות MYH, גם מיופתיה נמלינית ACTA1 וגם מיופתיה נמלינית TNNT1 העבירו את פרוטאום סיבי שריר השלד לכיוון סיבים בעלי עווית מהירה.
לאחר מכן, השוונו ישירות כל קבוצת חולים עם קבוצת ביקורת בריאה וזיהינו 256 ו-552 חלבונים בעלי ביטוי דיפרנציאלי במיאופתיות נמליניות של ACTA1 ו-TNNT1, בהתאמה (איור 6E-G ואיור משלים 11C, מערך נתונים משלים 21). ניתוח העשרת גנים גילה ירידה מתואמת בחלבוני מיטוכונדריה (איור 6H-I, מערך נתונים משלים 22). באופן מפתיע, למרות הדומיננטיות הדיפרנציאלית של סוגי סיבים במיאופתיות נמליניות של ACTA1 ו-TNNT1, ירידה זו הייתה בלתי תלויה לחלוטין בסוג הסיבים מבוססי MYH (איור 6H ואיורים משלימים 11D-I, מערך נתונים משלים 23). שלושה חלבונים מיקרוביאליים היו מווסתים גם הם במיאופתיות נמליניות של ACTA1 או TNNT1. שניים ממיקרו-חלבונים אלה, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (הידוע גם בשם LINC00598 או Lnc-FOXO1) ו- ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), הראו שפע שונה רק במיופתיחים מסוג 1. בעבר דווח כי ENSG00000215483_TR14_ORF67 ממלא תפקיד בוויסות מחזור התא.56 מצד שני, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (התואם ל- LINC01798) היה מוגבר הן במיופתיחים מסוג 1 והן במיופתיה מסוג 2A במיופתיה מסוג ACTA1-nemaline בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה (איור משלים 12A, מערך נתונים משלים 24). לעומת זאת, חלבונים ריבוזומליים לא הושפעו במידה רבה על ידי מיופתיה נמלינית, למרות ש-RPS17 היה מווסת כלפי מטה במיופתיה נמלינית ACTA1 (איור 6E).
ניתוח העשרה גילה גם עלייה בתהליכי מערכת החיסון במיופתיות נמליניות מסוג ACTA1 ו-TNNT1, בעוד שהידבקות תאים גברה גם היא במיופתיה נמלינית מסוג TNNT1 (איור 6H). העשרת הגורמים החוץ-תאיים הללו באה לידי ביטוי בכך שחלבוני המטריצה ​​החוץ-תאית הזיזו את PCA ב-PC1 ו-PC2 לכיוון שלילי (כלומר, לכיוון הסיבים הנפגעים ביותר) (איור 6J). שתי קבוצות החולים הראו ביטוי מוגבר של חלבונים חוץ-תאיים המעורבים בתגובות חיסוניות ובמנגנוני תיקון סרקולמליים, כגון אנקסינים (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 וחלבון האינטראקציה שלהם S100A1159 (איורים משלימים 12B-C). דווח בעבר שתהליך זה מוגבר בדיסטרופיות שרירים60 אך, למיטב ידיעתנו, לא נקשר בעבר למיופתיות נמליניות. תפקוד תקין של מנגנון מולקולרי זה נדרש לתיקון סרקולמלי לאחר פציעה ולאיחוי של מיוציטים חדשים שנוצרו עם סיבי שרירים58,61. לפיכך, הפעילות המוגברת של תהליך זה בשתי קבוצות החולים מצביעה על תגובה מתקנת לפגיעה הנגרמת מחוסר יציבות של סיבי השריר.
ההשפעות של כל אחת מהמיופתיה הנמלינית היו מתואמות היטב (r = 0.736) והראו חפיפה סבירה (איורים משלימים 11A-B), דבר המצביע על כך שלמיופתיה הנמלינית של ACTA1 ו-TNNT1 יש השפעות דומות על הפרוטאום. עם זאת, חלק מהחלבונים היו מווסתים רק במיופתיה הנמלינית של ACTA1 או TNNT1 (איורים משלימים 11A ו-C). החלבון הפרופיברוטי MFAP4 היה אחד החלבונים בעלי המווסת הגבוה ביותר במיופתיה הנמלינית של TNNT1 אך נותר ללא שינוי במיופתיה הנמלינית של ACTA1. SKIC8, רכיב בקומפלקס PAF1C האחראי על ויסות שעתוק הגן HOX, היה מווסת כלפי מטה במיופתיה הנמלינית של TNNT1 אך לא הושפע במיופתיה הנמלינית של ACTA1 (איור משלים 11A). השוואה ישירה בין מיופתיה נמלינית מסוג ACTA1 ו-TNNT1 גילתה ירידות גדולות יותר בחלבונים מיטוכונדריאליים ועלייה בחלבוני מערכת החיסון במיופתיה נמלינית מסוג TNNT1 (איור 6G-H ואיורים משלימים 11C ו-11H-I). נתונים אלה עולים בקנה אחד עם האטרופיה/דיסטרופיה הגדולה יותר שנצפתה במיופתיה נמלינית מסוג TNNT1 בהשוואה למיופתיה נמלינית מסוג TNNT1 (איור 6A), דבר המצביע על כך שמיופתיה נמלינית מסוג TNNT1 מייצגת צורה חמורה יותר של המחלה.
כדי להעריך האם ההשפעות שנצפו של מיופתיה נמלינית נמשכות ברמת השריר כולו, ביצענו ניתוח פרוטאומי בכמות גדולה של ביופסיות שריר מאותה קבוצה של חולי מיופתיה נמלינית TNNT1 והשווינו אותן לקבוצת ביקורת (n=3 לכל קבוצה) (איור משלים 13A, מערך נתונים משלים 25). כצפוי, קבוצת הביקורת הייתה קשורה קשר הדוק בניתוח הרכיבים העיקריים, בעוד שחולי מיופתיה נמלינית TNNT1 הציגו שונות גבוהה יותר בין-דגימה בדומה לזו שנראתה בניתוח סיבים בודדים (איור משלים 13B). ניתוח בכמות גדולה שחזור החלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (איור משלים 13C, מערך נתונים משלים 26) ותהליכים ביולוגיים (איור משלים 13D, מערך נתונים משלים 27) שהודגשו על ידי השוואת סיבים בודדים, אך איבד את היכולת להבחין בין סוגי סיבים שונים ולא הצליח להתחשב בהשפעות הטרוגניות של המחלה על פני סיבים.
יחד, נתונים אלה מראים כי פרוטאומיקה של מיופיב שריר יחיד יכולה להבהיר מאפיינים ביולוגיים קליניים שאינם ניתנים לזיהוי בשיטות ממוקדות כגון אימונובלוטינג. יתר על כן, נתונים אלה מדגישים את המגבלות של שימוש בהקלדה של סיבי אקטין (MYH) בלבד לתיאור אדפטציה פנוטיפית. ואכן, למרות שהחלפת סוג סיבים שונה בין מיופתיות נמליניות של אקטין וטרופונין, שתי המיופתיות הנמליניות מפרידות את הקלדה של סיבי MYH ממטבוליזם של סיבי שריר שלד לעבר פרוטאום שריר מהיר ופחות חמצוני.
הטרוגניות תאית היא קריטית כדי שרקמות יעמדו בדרישותיהן המגוונות. בשרירי שלד, זה מתואר לעתים קרובות כסוגי סיבים המאופיינים בדרגות שונות של ייצור כוח ועייפות. עם זאת, ברור שזה מסביר רק חלק קטן מהשונות של סיבי שריר השלד, שהיא הרבה יותר משתנה, מורכבת ורב-גונית ממה שחשבו בעבר. התקדמות טכנולוגית שופכת אור על הגורמים המווסתים סיבי שריר השלד. ואכן, הנתונים שלנו מצביעים על כך שייתכן שסיבים מסוג 2X אינם תת-סוג מובחן של סיבי שריר שלד. יתר על כן, זיהינו חלבונים מטבוליים, חלבונים ריבוזומליים וחלבונים הקשורים לתאים כגורמים עיקריים להטרוגניות של סיבי שריר השלד. על ידי יישום תהליך העבודה הפרוטאומי שלנו על דגימות מטופלים עם מיופתיה נמטודות, הדגמנו עוד כי טיפוס סיבים מבוסס MYH אינו משקף באופן מלא את ההטרוגניות של שרירי השלד, במיוחד כאשר המערכת מופרעת. ואכן, ללא קשר לסוג הסיב מבוסס MYH, מיופתיה נמטודות גורמת למעבר לכיוון סיבים מהירים ופחות חמצוניים.
סיבי שריר שלד מסווגים מאז המאה ה-19. ניתוחי אומיקס אחרונים אפשרו לנו להתחיל להבין את פרופילי הביטוי של סוגי סיבי MYH שונים ואת תגובותיהם לגירויים שונים. כפי שתואר כאן, לגישות אומיקס יש גם יתרון של רגישות גדולה יותר לכימות סמני סוג סיבים בהשוואה לשיטות מסורתיות מבוססות נוגדנים, מבלי להסתמך על כימות של סמן יחיד (או כמה) כדי להגדיר סוג סיב שריר שלד. השתמשנו בזרימות עבודה טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות משלימות ושילבנו את התוצאות כדי לבחון את הרגולציה התעתוקית והפוסט-תעתוקית של הטרוגניות סיבים בסיבים של שריר שלד אנושי. תהליך עבודה זה הביא לכישלון בזיהוי סיבים טהורים מסוג 2X ברמת החלבון ב-vastus lateralis של קבוצת הגברים הצעירים הבריאים שלנו. זה עולה בקנה אחד עם מחקרי סיב יחיד קודמים שמצאו <1% סיבי 2X טהורים ב-vastus lateralis בריא, אם כי יש לאשר זאת בשרירים אחרים בעתיד. הפער בין זיהוי סיבים 2X כמעט טהורים ברמת mRNA לבין סיבים 2A/2X מעורבים בלבד ברמת החלבון הוא תמוה. ביטוי mRNA של האיזופורם של MYH אינו צירקדי,67 דבר המצביע על כך שלא סביר ש"פספסנו" את אות ההתחלה של MYH2 בסיבים 2X לכאורה טהורים ברמת ה-RNA. הסבר אפשרי אחד, אם כי היפותטי לחלוטין, יכול להיות הבדלים ביציבות החלבון ו/או ה-mRNA בין האיזופורמים של MYH. ואכן, אף סיב מהיר אינו טהור ב-100% עבור אף איזופורם של MYH, ולא ברור האם רמות ביטוי mRNA של MYH1 בטווח 70-90% יביאו לשפע שווה של MYH1 ו-MYH2 ברמת החלבון. עם זאת, כאשר בוחנים את הטרנסקריפטום או הפרוטאום כולו, ניתוח אשכולות יכול לזהות בביטחון רק שני אשכולות נפרדים המייצגים סיבי שריר שלד איטיים ומהירים, ללא קשר להרכב ה-MYH המדויק שלהם. זה עולה בקנה אחד עם ניתוחים המשתמשים בגישות טרנסקריפטומיות של גרעין יחיד, אשר בדרך כלל מזהות רק שני אשכולות מיונוקלאריים נפרדים. 68, 69, 70 יתר על כן, למרות שמחקרים פרוטאומיים קודמים זיהו סיבים מסוג 2X, סיבים אלה אינם מתקבצים בנפרד משאר הסיבים המהירים ומראים רק מספר קטן של חלבונים בשפע שונה בהשוואה לסוגי סיבים אחרים המבוססים על MYH. 14 תוצאות אלו מצביעות על כך שעלינו לחזור לנקודת המבט של תחילת המאה ה-20 על סיווג סיבי שריר, שחילקה את סיבי שריר השלד האנושיים לא לשלושה סוגים נפרדים המבוססים על MYH, אלא לשני אשכולות המבוססים על תכונותיהם המטבוליות והכווצות. 63
חשוב מכך, יש לשקול את ההטרוגניות של סיבי שריר לאורך מספר ממדים. מחקרים קודמים בתחום "אומיקס" הצביעו בכיוון זה, והציעו שסיבי שריר שלד אינם יוצרים אשכולות נפרדים אלא מסודרים לאורך רצף. 11, 13, 14, 64, 71 כאן, אנו מראים כי בנוסף להבדלים בתכונות ההתכווצות והמטבוליות של שרירי שלד, ניתן להבדיל בין סיבי שריר לפי מאפיינים הקשורים לאינטראקציות בין תאים ולמנגנוני תרגום. ואכן, מצאנו הטרוגניות של ריבוזומים בסיבי שריר שלד התורמת להטרוגניות ללא תלות בסוגי סיבים איטיים ומהירים. הסיבה הבסיסית להטרוגניות משמעותית זו של סיבי שריר, ללא תלות בסוג סיבים איטיים ומהירים, נותרה לא ברורה, אך היא עשויה להצביע על ארגון מרחבי מיוחד בתוך פסיקולות שריר המגיבות בצורה אופטימלית לכוחות ועומסים ספציפיים, 72 תקשורת תאית או ספציפית לאיבר עם סוגי תאים אחרים במיקרו-סביבת השריר 73,74,75 או הבדלים בפעילות הריבוזומים בתוך סיבי שריר בודדים. אכן, הטרופלזמיה ריבוזומלית, בין אם באמצעות החלפה פאראלוגית של RPL3 ו-RPL3L ובין אם ברמה של 2'O-מתילציה של rRNA, הוכחה כקשורה להיפרטרופיה של שרירי שלד 76,77. יישומים רב-אומיים ומרחביים בשילוב עם אפיון פונקציונלי של סיבי שריר בודדים יקדמו עוד יותר את הבנתנו את ביולוגיית השרירים ברמה הרב-אומית 78.
על ידי ניתוח הפרוטאומות של מיופתיות בודדות מחולים עם מיופתיות נמליניות, הדגמנו גם את התועלת, היעילות והישימות של פרוטאומיקה של מיופתיות בודדות כדי להבהיר את הפתופיזיולוגיה הקלינית של שרירי השלד. יתר על כן, על ידי השוואת זרימת העבודה שלנו לניתוח פרוטאומי גלובלי, הצלחנו להדגים שפרוטאומיקה של מיופתיות בודדות מניבה את אותו עומק מידע כמו פרוטאומיקה של רקמות גלובליות ומרחיבה עומק זה על ידי התחשבות בהטרוגניות בין-סיבים ובסוג המיופייתיות. בנוסף להבדלים הצפויים (אם כי משתנים) ביחס סוגי הסיבים שנצפו במיופתיות נמליניות של ACTA1 ו-TNNT1 בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה,19 צפינו גם בשיפוץ חמצוני וחוץ-תאי ללא תלות בהחלפת סוגי סיבים בתיווך MYH. פיברוזיס דווח בעבר במיאופתיה נמלינית מסוג TNNT1.19 עם זאת, הניתוח שלנו מתבסס גם על ממצא זה על ידי גילוי רמות מוגברות של חלבונים הקשורים ללחץ המופרשים חוץ-תאיים, כגון אנקסינים, המעורבים במנגנוני תיקון סרקולמליים, במיופתיה של חולים עם מיופתיה נמלינית מסוג ACTA1 ו-TNNT1.57,58,59 לסיכום, רמות מוגברות של אנקסין במיופתיה של חולים עם מיופתיה נמלינית עשויות לייצג תגובה תאית לתיקון מיופתיה אטרופית חמורה.
למרות שמחקר זה מייצג את ניתוח האומיקס הגדול ביותר של שריר שלם בסיב בודד בבני אדם עד כה, הוא אינו נטול מגבלות. בודדנו סיבי שריר שלד ממדגם קטן והומוגני יחסית של משתתפים ומשריר בודד (vastus lateralis). לכן, בלתי אפשרי לשלול את קיומן של אוכלוסיות סיבים ספציפיות על פני סוגי שרירים ובקצוות של פיזיולוגיית השרירים. לדוגמה, איננו יכולים לשלול את האפשרות של תת-קבוצה של סיבים אולטרה-מהירים (למשל, סיבים טהורים 2X) המופיעים אצל ספרינטרים מאומנים מאוד ו/או ספורטאי כוח79 או במהלך תקופות של חוסר פעילות שרירית66,80. יתר על כן, גודל המדגם המוגבל של המשתתפים מנע מאיתנו לחקור הבדלים בין המינים בהטרוגניות סיבים, מכיוון שידוע כי יחסי סוגי סיבים שונים בין גברים לנשים. יתר על כן, לא הצלחנו לבצע ניתוחים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים על אותם סיבי שריר או דגימות מאותם משתתפים. ככל שאנחנו ואחרים ממשיכים לייעל ניתוחי תאים בודדים ומיופתיים בודדים באמצעות ניתוח אומיקס כדי להשיג קלט דגימה נמוך במיוחד (כפי שמודגם כאן בניתוח סיבים מחולים עם מיופתיה מיטוכונדריאלית), ההזדמנות לשלב גישות מולטי-אומיקס (ופונקציונליות) בתוך סיבי שריר בודדים מתבררת.
בסך הכל, הנתונים שלנו מזהים ומסבירים גורמים תעתוקיים ופוסט-תעתוקיים המשפיעים על ההטרוגניות של שרירי השלד. באופן ספציפי, אנו מציגים נתונים המאתגרים דוגמה ארוכת שנים בפיזיולוגיה של שרירי השלד הקשורה להגדרה הקלאסית המבוססת על MYH של סוגי סיבים. אנו מקווים לחדש את הדיון ובסופו של דבר לחשוב מחדש על הבנתנו את סיווג סיבי שריר השלד וההטרוגניות שלהם.
ארבעה עשר משתתפים לבנים (12 גברים ו-2 נשים) הסכימו מרצונם להשתתף במחקר זה. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי גנט (BC-10237), עמד בהצהרת הלסינקי משנת 2013, ונרשם באתר ClinicalTrials.gov (NCT05131555). מאפיינים כלליים של המשתתפים מוצגים בטבלה המשלימה 1. לאחר קבלת הסכמה מדעת בעל פה ובכתב, המשתתפים עברו בדיקה רפואית לפני הכללתם הסופית במחקר. המשתתפים היו צעירים (22-42 שנים), בריאים (ללא מצבים רפואיים, ללא היסטוריה של עישון) ופעילים גופנית במידה בינונית. צריכת חמצן מקסימלית נקבעה באמצעות ארגומטר מדרגה להערכת כושר גופני כמתואר קודם לכן. 81
דגימות ביופסיה של שריר נאספו במנוחה ובצום שלוש פעמים, במרווח של 14 ימים זו מזו. מכיוון שדגימות אלו נאספו כחלק ממחקר גדול יותר, המשתתפים צרכו פלצבו (לקטוז), אנטגוניסט לקולטן H1 (540 מ"ג פקסופנאדין) או אנטגוניסט לקולטן H2 (40 מ"ג פמוטידין) 40 דקות לפני הביופסיה. בעבר הדגמנו כי אנטגוניסטים אלו של קולטן היסטמין אינם משפיעים על כושר שרירי השלד במנוחה81, ולא נצפתה התקבצות הקשורה למצב הגופני בעלילות בקרת האיכות שלנו (איורים משלימים 3 ו-6). תזונה סטנדרטית (41.4 קלוריות/ק"ג משקל גוף, 5.1 גרם/ק"ג משקל גוף פחמימות, 1.4 גרם/ק"ג משקל גוף חלבון ו-1.6 גרם/ק"ג משקל גוף שומן) נשמרה במשך 48 שעות לפני כל יום ניסוי, וארוחת בוקר סטנדרטית (1.5 גרם/ק"ג משקל גוף פחמימות) נצרכה בבוקר יום הניסוי. תחת הרדמה מקומית (0.5 מ"ל לידוקאין 1% ללא אפינפרין), נלקחו ביופסיות שריר משריר ה-vastus lateralis באמצעות שאיבה דרך העור של Bergström.82 דגימות שריר הוטבעו מיד ב-RNAlater ואוחסנו ב-4°C עד לניתוח ידני של הסיבים (עד 3 ימים).
צרורות של סיבי שריר טריים שבודדו הועברו למדיום RNAlater טרי בצלחת תרבית. לאחר מכן, סיבי שריר בודדים נותחו ידנית באמצעות סטריאומיקרוסקופ ופינצטה דקה. עשרים וחמישה סיבים נותחו מכל ביופסיה, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לבחירת סיבים מאזורים שונים בביופסיה. לאחר הניתוח, כל סיב הוטבל בעדינות ב-3 מיקרוליטר של בופר ליזיס (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) המכיל אנזימי פרוטאינאז K ואנזימי DNase להסרת חלבונים ו-DNA לא רצויים. ליזיס התאים והסרת החלבון/DNA החלו לאחר מכן על ידי מערבולת קצרה, סיבוב הנוזל במיקרוצנטריפוגה ודגירה בטמפרטורת החדר (10 דקות). לאחר מכן הודגר הליזט במכונה תרמית (T100, Bio-Rad) ב-37°C למשך 5 דקות, 75°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן אוחסן מיד ב-80°C- עד לעיבוד נוסף.
ספריות RNA פוליאדנילציה תואמות Illumina הוכנו מ-2 מיקרוליטר של ליזט של סיבי שריר באמצעות ערכת הכנת ספריית QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen). שיטות מפורטות ניתן למצוא במדריך היצרן. התהליך מתחיל בסינתזה של cDNA של הגדיל הראשון על ידי שעתוק לאחור, שבמהלכו מוכנסים מזהים מולקולריים ייחודיים (UMIs) וברקודים ספציפיים לדגימה של i1 כדי להבטיח איגום דגימות ולהפחית את השונות הטכנית במהלך עיבוד ההמשך. לאחר מכן, cDNA מ-96 סיבי שריר נאסף ומטוהר באמצעות חרוזים מגנטיים, לאחר מכן מוסר RNA וסינתזה של הגדיל השני מבוצעת באמצעות פריימרים אקראיים. הספרייה מטוהרת באמצעות חרוזים מגנטיים, מוסיפים תגיות i5/i7 ספציפיות לאיגום, ומוגברת באמצעות PCR. שלב הטיהור הסופי מייצר ספריות תואמות Illumina. איכות כל מאגר ספריות הוערכה באמצעות ערכת ניתוח DNA של מקטעים קטנים ברגישות גבוהה (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
בהתבסס על כימות קיוביט, קבוצת המאגרי קבוצת המחקר אוגדה נוספת בריכוזים אקווימולריים (2 ננומטר). לאחר מכן, קבוצת המאגרי קבוצת המחקר רוצפה במכשיר NovaSeq 6000 במצב סטנדרטי באמצעות ערכת הריאגנטים NovaSeq S2 (1 × 100 נוקלאוטידים) עם טעינה של 2 ננומטר (4% PhiX).
הצינור שלנו מבוסס על צינור ניתוח הנתונים של QuantSeq Pool של Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). הנתונים עברו תחילה פירוק ריבוב באמצעות bcl2fastq2 (v2.20.0) בהתבסס על אינדקס i7/i5. לאחר מכן, קריאה 2 עברה פירוק ריבוב באמצעות idemux (v0.1.6) בהתבסס על ברקוד הדגימה i1 ורצפי UMI חולצו באמצעות umi_tools (v1.0.1). לאחר מכן, הקריאות נחתכו באמצעות cutadapt (v3.4) בסבבים מרובים כדי להסיר קריאות קצרות (אורך <20) או קריאות המורכבות אך ורק מרצפי מתאם. לאחר מכן, הקריאות יושרו לגנום האנושי באמצעות STAR (v2.6.0c) וקבצי BAM אנדקסו באמצעות SAMtools (v1.11). קריאות כפולות הוסרו באמצעות umi_tools (v1.0.1). לבסוף, ספירת יישור בוצעה באמצעות featureCounts ב-Subread (v2.0.3). בקרת איכות בוצעה באמצעות FastQC (גרסה 0.11.9) במספר שלבים ביניים של הצינור.
כל עיבוד הביואינפורמטיקה והוויזואליזציה הנוספים בוצעו ב-R (גרסה 4.2.3), בעיקר באמצעות זרימת העבודה של Seurat (גרסה 4.4.0). 83 לכן, ערכי UMI בודדים ומטריצות מטא-דאטה הומרו לאובייקטים של Seurat. גנים שהתבטאו בפחות מ-30% מכלל הסיבים הוסרו. דגימות באיכות נמוכה הוסרו על סף מינימלי של 1000 ערכי UMI ו-1000 גנים שזוהו. בסופו של דבר, 925 סיבים עברו את כל שלבי סינון בקרת האיכות. ערכי UMI נורמלו באמצעות שיטת Seurat SCTransform v2, 84 כולל את כל 7418 המאפיינים שזוהו, וההבדלים בין המשתתפים עברו רגרסיה. את כל המטא-דאטה הרלוונטיים ניתן למצוא במערך הנתונים המשלים 28.