תודה שביקרת ב-Nature.com. לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן חדש יותר (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
הקמת מודלים של בעלי חיים של שינוי מודי (MC) הוא בסיס חשוב ללימוד MC. 54 ארנבות לבנים מניו זילנד חולקו לקבוצת ניתוח דמה, קבוצת השתלת שרירים (קבוצת ME) וקבוצת השתלת גרעין פולפוסוס (קבוצת NPE). בקבוצת ה-NPE, הדיסק הבין-חולייתי נחשף בגישה כירורגית מותנית קדמית והשתמשו במחט כדי לנקב את גוף החוליה L5 ליד לוחית הקצה. NP הוצא מהדיסק הבין חולייתי L1/2 על ידי מזרק והוזרק לתוכו. קידוח חור בעצם התת-כונדרלית. ההליכים הכירורגיים ושיטות הקידוח בקבוצת השתלת השרירים ובקבוצת ניתוח הדמה היו זהים לאלה בקבוצת השתלת NP. בקבוצת ME, חתיכת שריר הונחה לתוך החור, ואילו בקבוצת ניתוח הדמה לא הוכנס דבר לתוך החור. לאחר הניתוח בוצעו סריקת MRI ובדיקות ביולוגיות מולקולריות. האות בקבוצת NPE השתנה, אך לא היה שינוי אות ברור בקבוצת ניתוח הדמה ובקבוצת ME. תצפית היסטולוגית הראתה שנצפה שגשוג רקמות לא תקין באתר ההשתלה, והביטוי של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ גדל בקבוצת ה-NPE. השתלה של NP לתוך העצם התת-כונדרלית יכולה ליצור מודל חיה של MC.
שינויים מודיים (MC) הם נגעים של לוחות הקצה של החוליות ומח העצם הסמוך הנראים בהדמיית תהודה מגנטית (MRI). הם נפוצים למדי אצל אנשים עם תסמינים קשורים1. מחקרים רבים הדגישו את החשיבות של MC בשל הקשר שלו לכאבי גב תחתון (LBP)2,3. de Roos et al.4 ו-Modic et al.5 תיארו לראשונה באופן עצמאי שלושה סוגים שונים של הפרעות אות תת-כונדרליות במח עצם החוליה. שינויים מסוג Modic I הם hypointense על רצפים במשקל T1 (T1W) ו-hyperintense על רצפים במשקל T2 (T2W). נגע זה חושף לוחות קצה של פיסורה ורקמת גרגירי כלי דם סמוכות במח העצם. שינויים מסוג Modic II מראים אות גבוה בשני רצפי T1W ו-T2W. בסוג זה של נגע ניתן למצוא הרס של לוחית הקצה וכן החלפה שומנית היסטולוגית של מח העצם הסמוך. שינויים מסוג Modic III מראים אות נמוך ברצפי T1W ו-T2W. נצפו נגעים טרשתיים התואמים ללוחיות הקצה6. MC נחשבת למחלה פתולוגית של עמוד השדרה וקשורה קשר הדוק למחלות ניווניות רבות של עמוד השדרה7,8,9.
בהתחשב בנתונים הזמינים, מספר מחקרים סיפקו תובנות מפורטות לגבי האטיולוגיה והמנגנונים הפתולוגיים של MC. אלברט וחב'. הציע כי MC עשוי להיגרם על ידי פריצת דיסק8. הו ואח'. ייחס את MC לניוון דיסק חמור10. קרוק הציע את המושג "פריצת דיסק פנימית", הקובע כי טראומה חוזרת של דיסק עלולה להוביל למיקרו-קרעים בלוח הקצה. לאחר היווצרות שסע, הרס לוחית הקצה על ידי הגרעין פולפוסוס (NP) עשוי לעורר תגובה אוטואימונית, מה שמוביל עוד יותר להתפתחות של MC11. מא ועוד. חלקו דעה דומה ודיווחו כי אוטואימוניות הנגרמת על ידי NP ממלאת תפקיד מפתח בפתוגנזה של MC12.
תאי מערכת החיסון, במיוחד לימפוציטים מסייעים CD4+ T, ממלאים תפקיד קריטי בפתוגנזה של אוטואימוניות13. תת-קבוצת Th17 שהתגלתה לאחרונה מייצרת את הציטוקין הפרה-דלקתי IL-17, מעודדת ביטוי כימוקין וממריץ תאי T באיברים פגועים לייצר IFN-γ14. תאי Th2 ממלאים גם תפקיד ייחודי בפתוגנזה של תגובות חיסון. ביטוי של IL-4 כתא Th2 מייצג יכול להוביל לתוצאות אימונופתולוגיות חמורות15.
למרות שמחקרים קליניים רבים נערכו על MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, עדיין חסרים מודלים מתאימים לניסויים בבעלי חיים שיכולים לחקות את תהליך ה-MC המתרחש לעתים קרובות בבני אדם ויכולים להיות משמש כדי לחקור את האטיולוגיה או טיפולים חדשים כגון טיפול ממוקד. עד כה, רק כמה מודלים של בעלי חיים של MC דווחו לחקור את המנגנונים הפתולוגיים הבסיסיים.
בהתבסס על התיאוריה האוטואימונית שהוצעו על ידי אלברט ומא, מחקר זה הקים מודל ארנב MC פשוט וניתן לשחזור על ידי השתלה אוטומטית של NP ליד לוחית הקצה החוליה הקודחת. מטרות אחרות הן להתבונן במאפיינים ההיסטולוגיים של מודלים של בעלי חיים ולהעריך את המנגנונים הספציפיים של NP בפיתוח MC. לשם כך, אנו משתמשים בטכניקות כמו ביולוגיה מולקולרית, MRI ומחקרים היסטולוגיים כדי לחקור את התקדמות MC.
שני ארנבים מתו מדימום במהלך הניתוח, וארבעה ארנבות מתו במהלך הרדמה במהלך MRI. 48 הארנבות הנותרות שרדו ולא הראו סימנים התנהגותיים או נוירולוגיים לאחר הניתוח.
MRI מראה שעוצמת האות של הרקמה המוטבעת בחורים שונים שונה. עוצמת האות של גוף החוליה L5 בקבוצת NPE השתנתה בהדרגה לאחר 12, 16 ו-20 שבועות לאחר ההחדרה (רצף T1W הראה אות נמוך, ורצף T2W הראה אות מעורב בתוספת אות נמוך) (איור 1C), בעוד שמראה ה-MRI משתי הקבוצות האחרות של חלקים משובצים נותרו יציבים יחסית באותה תקופה (איור 1A, B).
(א) בדיקות MRI עוקבות מייצגות של עמוד השדרה המותני של הארנב ב-3 נקודות זמן. לא נמצאו חריגות איתות בתמונות של קבוצת הניתוח הדמה. (ב) מאפייני האותות של גוף החוליה בקבוצת ME דומים לאלו בקבוצת ניתוח הדמה, ולא נצפה שינוי אות משמעותי באתר ההטבעה לאורך זמן. (ג) בקבוצת NPE, האות הנמוך נראה בבירור ברצף T1W, והאות המעורב והאות הנמוך נראים בבירור ברצף T2W. מהתקופה של 12 השבועות לתקופה של 20 השבועות, האותות הגבוהים הספוראדיים המקיפים את האותות הנמוכים ברצף T2W פוחתים.
ניתן לראות היפרפלזיה ברורה של עצם באתר ההשתלה של גוף החוליה בקבוצת ה-NPE, והיפרפלזיה של העצם מתרחשת מהר יותר מ-12 עד 20 שבועות (איור 2C) בהשוואה לקבוצת ה-NPE, לא נצפה שינוי משמעותי בחוליות המודליות. גופים; קבוצת דמה וקבוצת ME (איור 2C) 2A,B).
(א) פני השטח של גוף החוליה בחלק המושתל חלקים מאוד, החור מתרפא היטב, ואין היפרפלזיה בגוף החוליה. (ב) צורת המקום המושתל בקבוצת ME דומה לזו בקבוצת הניתוח הדמה, ואין שינוי ברור במראה המקום המושתל לאורך זמן. (ג) היפרפלזיה של העצם התרחשה באתר המושתל בקבוצת ה-NPE. ההיפרפלזיה של העצם גדלה במהירות ואף התרחבה דרך הדיסק הבין חולייתי לגוף החוליה הנגדי.
ניתוח היסטולוגי מספק מידע מפורט יותר על היווצרות עצם. איור 3 מציג את התמונות של הקטעים שלאחר הניתוח מוכתמים ב-H&E. בקבוצת ניתוח הדמה, הכונדרוציטים היו מסודרים היטב ולא זוהה ריבוי תאים (איור 3A). המצב בקבוצת ME היה דומה לזה בקבוצת ניתוח הדמה (איור 3B). עם זאת, בקבוצת ה-NPE, מספר רב של כונדרוציטים ושגשוג של תאים דמויי NP נצפו באתר ההשתלה (איור 3C);
(א) ניתן לראות טרבקולות ליד צלחת הקצה, הכונדרוציטים מסודרים בצורה מסודרת עם גודל וצורה של תאים אחידים וללא ריבוי (40 פעמים). (ב) מצבו של מקום ההשתלה בקבוצת ME דומה לזה של קבוצת הדמה. ניתן לראות טרבקולות וכונדרוציטים, אך אין ריבוי ברור באתר ההשתלה (פי 40). (ב) ניתן לראות שכונדרוציטים ותאים דמויי NP מתרבים באופן משמעותי, והצורה והגודל של כונדרוציטים אינם אחידים (פי 40).
הביטוי של mRNA אינטרלוקין 4 (IL-4), mRNA אינטרלוקין 17 (IL-17) ו-mRNA של אינטרפרון γ (IFN-γ) נצפו הן בקבוצות NPE והן בקבוצות ME. כאשר הושוו רמות הביטוי של גני המטרה, ביטויי הגנים של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ עלו באופן משמעותי בקבוצת ה-NPE בהשוואה לאלו של קבוצת ME וקבוצת הניתוח הדמה (איור 4). (P < 0.05). בהשוואה לקבוצת הניתוח הדמה, רמות הביטוי של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ בקבוצת ME עלו רק מעט ולא הגיעו לשינוי סטטיסטי (P > 0.05).
ביטוי ה-mRNA של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ בקבוצת NPE הראה מגמה גבוהה משמעותית מאלו בקבוצת הניתוח הדמה ובקבוצת ME (P <0.05).
לעומת זאת, רמות הביטוי בקבוצת ME לא הראו הבדל משמעותי (P>0.05).
אנליזה של Western blot בוצעה באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית נגד IL-4 ו-IL-17 כדי לאשר את דפוס הביטוי המשתנה של mRNA. כפי שמוצג באיורים 5A,B, בהשוואה לקבוצת ME וקבוצת הפעולה הדמה, רמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 בקבוצת NPE עלו באופן משמעותי (P <0.05). בהשוואה לקבוצת ניתוח הדמה, גם רמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 בקבוצת ME לא הצליחו להגיע לשינויים מובהקים סטטיסטית (P>0.05).
(א) רמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 בקבוצת NPE היו גבוהות משמעותית מאלו בקבוצת ME ובקבוצת הפלצבו (P <0.05). (ב) היסטוגרמה כתם מערבי.
בשל המספר המצומצם של דגימות אנושיות שהתקבלו במהלך הניתוח, מחקרים ברורים ומפורטים על הפתוגנזה של MC קשים במקצת. ניסינו להקים מודל חיה של MC כדי לחקור את המנגנונים הפתולוגיים הפוטנציאליים שלו. במקביל, נעשה שימוש בהערכה רדיולוגית, הערכה היסטולוגית והערכה ביולוגית מולקולרית כדי לעקוב אחר מהלך MC המושרה על ידי NP autograft. כתוצאה מכך, מודל ההשתלה של NP הביא לשינוי הדרגתי בעוצמת האות מנקודות זמן של 12 שבועות ל-20 שבועות (אותות נמוכה מעורבת ברצפי T1W ואות נמוך ברצפי T2W), המעידה על שינויים ברקמה, וההיסטולוגי והמולקולרי הערכות ביולוגיות אישרו את תוצאות המחקר הרדיולוגי.
תוצאות ניסוי זה מראות ששינויים חזותיים והיסטולוגיים התרחשו באתר של הפרת גוף החוליה בקבוצת NPE. במקביל, נצפתה הביטוי של גנים IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, כמו גם IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, מה שמעיד על הפרה של רקמת גרעין pulposus עצמוני בחוליה. הגוף עלול לגרום לסדרה של שינויים אות ומורפולוגיים. קל לגלות שמאפייני האותות של גופי החוליות של מודל החיות (אות נמוך ברצף T1W, אות מעורב ואות נמוך ברצף T2W) דומים מאוד לאלו של תאי חוליות אנושיים, וגם מאפייני ה-MRI לאשר את התצפיות של היסטולוגיה ואנטומיה גסה, כלומר, השינויים בתאי גוף החוליות מתקדמים. למרות שהתגובה הדלקתית הנגרמת על ידי טראומה חריפה עשויה להופיע זמן קצר לאחר הדקירה, תוצאות MRI הראו ששינויי אותות הולכים וגדלים הופיעו 12 שבועות לאחר הדקירה ונמשכו עד 20 שבועות ללא כל סימני התאוששות או היפוך של שינויי MRI. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-NP חולייתית אוטולוגית היא שיטה אמינה לביסוס MV פרוגרסיבי בארנבות.
מודל פנצ'ר זה דורש מיומנות נאותה, זמן ומאמץ כירורגי. בניסויים ראשוניים, דיסקציה או גירוי מוגזם של מבני הרצועה הפרה-חולייתית עלולים לגרום להיווצרות אוסטאופיטים בחוליות. יש להיזהר שלא לפגוע או לגרות את הדיסקים הסמוכים. מכיוון שיש לשלוט בעומק החדירה כדי להשיג תוצאות עקביות וניתנות לשחזור, יצרנו תקע באופן ידני על ידי חיתוך הנדן של מחט באורך 3 מ"מ. שימוש בפקק זה מבטיח עומק קידוח אחיד בגוף החוליה. בניסויים ראשוניים, שלושה מנתחים אורטופדים שהיו מעורבים בניתוח מצאו מחטים בגודל 16 שקל יותר לעבוד איתן מאשר במחטים בגודל 18 או בשיטות אחרות. כדי למנוע דימום מופרז במהלך הקידוח, החזקת המחט בשקט למשך זמן מה תספק חור החדרה מתאים יותר, דבר המצביע על כך שניתן לשלוט בדרגה מסוימת של MC בדרך זו.
למרות שמחקרים רבים התמקדו ב-MC, מעט ידוע על האטיולוגיה והפתוגנזה של MC25,26,27. בהתבסס על מחקרים קודמים שלנו, מצאנו כי אוטואימוניות ממלאת תפקיד מפתח בהתרחשות ובהתפתחות של MC12. מחקר זה בדק את הביטוי הכמותי של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, שהם מסלולי ההתמיינות העיקריים של תאי CD4+ לאחר גירוי אנטיגן. במחקר שלנו, בהשוואה לקבוצה השלילית, לקבוצת NPE היה ביטוי גבוה יותר של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, וגם רמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 היו גבוהות יותר.
מבחינה קלינית, ביטוי IL-17 mRNA מוגבר בתאי NP מחולים עם פריצת דיסק28. רמות ביטוי מוגברות של IL-4 ו-IFN-γ נמצאו גם במודל של פריצת דיסק חריפה ללא דחיסה בהשוואה לביקורות בריאים29. IL-17 ממלא תפקיד מפתח בדלקת, פגיעה ברקמות במחלות אוטואימוניות30 ומגביר את התגובה החיסונית ל-IFN-γ31. פציעה מוגברת של רקמות בתיווך IL-17 דווחה בעכברי MRL/lpr32 ובעכברים הרגישים לאוטואימוניות33. IL-4 יכול לעכב את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים (כגון IL-1β ו-TNFα) והפעלת מקרופאגים34. דווח כי ביטוי ה-mRNA של IL-4 היה שונה בקבוצת NPE בהשוואה ל-IL-17 ו-IFN-γ באותה נקודת זמן; ביטוי ה-mRNA של IFN-γ בקבוצת ה-NPE היה גבוה משמעותית מזה בקבוצות האחרות. לכן, ייצור IFN-γ עשוי להיות מתווך של התגובה הדלקתית הנגרמת על ידי אינטרקלציה של NP. מחקרים הראו ש-IFN-γ מיוצר על ידי סוגי תאים מרובים, כולל תאי T עוזרים מסוג 1 פעילים, תאי הורגים טבעיים ומקרופאגים35,36, והוא ציטוקין מפתח פרו-דלקתי המקדם תגובות חיסוניות37.
מחקר זה מציע שתגובה אוטואימונית עשויה להיות מעורבת בהתרחשות ובהתפתחות של MC. Luoma et al. מצאו שמאפייני האות של MC ו-NP בולט דומים ב-MRI, ושניהם מראים אות גבוה ברצף T2W38. אושרו כמה ציטוקינים קשורים באופן הדוק להתרחשות של MC, כגון IL-139. מא ועוד. הציע שלהבלטה כלפי מעלה או מטה של NP עשויה להיות בעלת השפעה רבה על התרחשות והתפתחות של MC12. Bobechko40 ו-Herzbein et al.41 דיווחו ש-NP היא רקמה אימונו-סובלנית שאינה יכולה להיכנס למחזור הדם מלידה. בליטות NP מכניסות גופים זרים לאספקת הדם, ובכך מתווכות תגובות אוטואימוניות מקומיות42. תגובות אוטואימוניות יכולות לגרום למספר רב של גורמים חיסוניים, וכאשר גורמים אלו נחשפים ללא הרף לרקמות, הם עלולים לגרום לשינויים באיתות43. במחקר זה, ביטוי יתר של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ הם גורמים חיסוניים אופייניים, מה שמוכיח עוד יותר את הקשר ההדוק בין NP ו-MCs44. מודל בעלי חיים זה מחקה היטב את פריצת הדרך והכניסה לצלחת הקצה. תהליך זה חשף עוד יותר את השפעת האוטואימוניות על MC.
כצפוי, מודל החיות הזה מספק לנו פלטפורמה אפשרית ללימוד MC. עם זאת, למודל זה עדיין יש מגבלות מסוימות: ראשית, בשלב התצפית על בעלי חיים, יש להרדים כמה ארנבות בשלב הביניים לצורך בדיקות היסטולוגיות וביולוגיה מולקולרית, כך שחלק מהחיות "יוצאות מכלל שימוש" עם הזמן. שנית, למרות שנקבעו שלוש נקודות זמן במחקר זה, למרבה הצער, דגמנו רק סוג אחד של MC (שינוי מסוג Modic I), כך שזה לא מספיק כדי לייצג את תהליך התפתחות המחלה האנושית, ויש להגדיר יותר נקודות זמן ל טוב יותר לצפות בכל שינויי האות. שלישית, השינויים במבנה הרקמה אכן יכולים להיות מוצגים בבירור על ידי צביעה היסטולוגית, אך כמה טכניקות מיוחדות יכולות לחשוף טוב יותר את השינויים המיקרוסטרוקטורליים במודל זה. לדוגמה, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של אור מקוטב כדי לנתח את היווצרות סחוס פיברו בדיסקים בין חולייתיים של ארנב45. ההשפעות ארוכות הטווח של NP על MC ו-endplate דורשות מחקר נוסף.
חמישים וארבעה ארנבות לבנים מניו זילנד (משקל כ-2.5-3 ק"ג, גיל 3-3.5 חודשים) חולקו באופן אקראי לקבוצת ניתוח דמה, קבוצת השתלת שרירים (קבוצת ME) וקבוצת השתלת שורש עצב (קבוצת NPE). כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים טיאנג'ין, ושיטות הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות.
כמה שיפורים נעשו בטכניקה הכירורגית של S. Sobajima 46. כל ארנב הונח בתנוחת שכיבה לרוחב והמשטח הקדמי של חמישה דיסקים בין-חולייתיים מותניים עוקבים (IVDs) נחשף באמצעות גישה retroperitoneal posterolateral. כל ארנב קיבל הרדמה כללית (20% urethane, 5 מ"ל/ק"ג דרך וריד האוזן). בוצע חתך עורי אורכי מהקצה התחתון של הצלעות ועד לשולי האגן, 2 ס"מ גחון לשרירים הפרה-חולייתיים. עמוד השדרה הקדמי הימני מ-L1 ל-L6 נחשף על ידי דיסקציה חדה ובוטה של הרקמה התת-עורית, הרקמה הרטרופריטונאלית והשרירים (איור 6A). רמת הדיסק נקבעה באמצעות שולי האגן כנקודת ציון אנטומית לרמת הדיסק L5-L6. השתמש במחט לנקב בגודל 16 כדי לקדוח חור ליד לוחית הקצה של חוליית L5 לעומק של 3 מ"מ (איור 6B). השתמש במזרק של 5 מ"ל כדי לשאוב את הגרעין העצמי בדיסק הבין חולייתי L1-L2 (איור 6C). הסר את הגרעין הפולפוסוס או השריר בהתאם לדרישות של כל קבוצה. לאחר העמקת חור הקידוח, מניחים תפרים נספגים על הפאשיה העמוקה, הפאשיה השטחית והעור, תוך הקפדה על פגיעה ברקמת הפריוסטלית של גוף החוליה במהלך הניתוח.
(א) הדיסק L5-L6 נחשף באמצעות גישה retroperitoneal posterolateral. (ב) השתמש במחט בגודל 16 כדי לקדוח חור ליד לוחית הקצה L5. (ג) MFs אוטולוגיים נקצרים.
הרדמה כללית ניתנה עם 20% urethane (5 מ"ל/ק"ג) שניתנו דרך וריד האוזן, וצילומי עמוד השדרה המותני חזרו על עצמם בשבועות 12, 16 ו-20 לאחר הניתוח.
ארנבות הוקרבו על ידי הזרקה תוך שרירית של קטמין (25.0 מ"ג/ק"ג) ונתרן פנטוברביטל תוך ורידי (1.2 גרם/ק"ג) ב-12, 16 ו-20 שבועות לאחר הניתוח. כל עמוד השדרה הוסר לצורך ניתוח היסטולוגי ובוצע ניתוח אמיתי. שיעתוק הפוך כמותי (RT-qPCR) ו-Western blotting שימשו כדי לזהות שינויים בגורמים חיסוניים.
בדיקות MRI בוצעו בארנבות באמצעות מגנט קליני 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) מצויד במקלט סליל גפיים אורתוגונלי. ארנבות הורדמו עם 20% urethane (5 מ"ל/ק"ג) דרך וריד האוזן ולאחר מכן הונחו בשכיבה בתוך המגנט כשהאזור המותני מרוכז על סליל משטח עגול בקוטר 5 אינץ' (GE Medical Systems). תמונות לוקליזטור קורונלי T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) נרכשו כדי להגדיר את מיקום הדיסק המותני מ-L3-L4 ל-L5-L6. פרוסות משוקללות למישור Sagittal T2 נרכשו עם ההגדרות הבאות: רצף ספין-הד מהיר עם זמן חזרה (TR) של 2200 ms וזמן הד (TE) של 70 ms, מטריצה; שדה ראייה של 260 ושמונה גירויים; עובי החיתוך היה 2 מ"מ, הפער היה 0.2 מ"מ.
לאחר צילום התצלום האחרון והארנב האחרון נהרג, הוסרו הדיסקים הדמה, המוטבעים בשרירים וה-NP לבדיקה היסטולוגית. הרקמות נקבעו בפורמלין נייטרלי 10% מאוחסן במשך שבוע אחד, נמחקו עם חומצה אתילן-דיאמין-טטרה-אצטית וחתכו פרפין. גושי רקמות הוטבעו בפרפין וחתכו למקטעים סגיטליים (5 מיקרומטר בעובי) באמצעות מיקרוטום. קטעים נצבעו בהמטוקסילין ואאוזין (H&E).
לאחר איסוף הדיסקים הבין-חולייתיים מהארנבות בכל קבוצה, ה-RNA הכולל הוצא באמצעות עמודת UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) לפי הוראות היצרן ומערכת ImProm II שעתוק לאחור (Promega Inc. , מדיסון, WI, ארה"ב). בוצע תמלול הפוך.
RT-qPCR בוצע באמצעות Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ארה"ב) ו-SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. נפח התגובה של PCR היה 20 μl והכיל 1.5 μl של cDNA מדולל ו-0.2 μM של כל פריימר. פריימרים תוכננו על ידי OligoPerfect Designer (Invitrogen, ולנסיה, קליפורניה) ויוצרו על ידי Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (סין) (טבלה 1). נעשה שימוש בתנאי המחזור התרמיים הבאים: שלב הפעלה ראשוני של פולימראז ב-94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 15 שניות כל אחד ב-94 מעלות צלזיוס לדנטורציה של תבנית, חישול למשך דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס, הארכה וקרינה. המדידות בוצעו במשך דקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס. כל הדגימות הוגברו שלוש פעמים והערך הממוצע שימש לניתוח RT-qPCR. נתוני הגברה נותחו באמצעות FlexStation 3 (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, קליפורניה, ארה"ב). ביטוי הגנים IL-4, IL-17 ו-IFN-γ נורמלו לבקרה האנדוגנית (ACTB). רמות ביטוי יחסיות של mRNA מטרה חושבו בשיטת 2-ΔΔCT.
החלבון הכולל הוצא מרקמות באמצעות הומוגנית רקמה במאגר תמוגה של RIPA (המכיל קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז) ולאחר מכן בוצע בצנטריפוגה ב-13,000 סל"ד למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת רקמה. חמישים מיקרוגרם של חלבון הועמסו לכל נתיב, מופרדים על ידי 10% SDS-PAGE, ולאחר מכן הועברו לממברנת PVDF. החסימה בוצעה בחלב יבש ללא שומן של 5% במלח טריס (TBS) המכיל 0.1% Tween 20 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הממברנה הודגרה עם נוגדן ראשוני אנטי-דקורין ארנב (מדולל 1:200; בוסטר, ווהאן, סין) (מדולל 1:200; Bioss, בייג'ינג, סין) למשך הלילה ב-4°C והגיב בימים השניים; עם נוגדן משני (אימונוגלובולין G נגד ארנב עיזים בדילול 1:40,000) בשילוב עם פרוקסידאז חזרת (בוסטר, ווהאן, סין) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אותות הכתם המערבי זוהו על ידי כימילומינסנציה מוגברת על הממברנה הכימילומינסצנטית לאחר הקרנת רנטגן. לצורך ניתוח דנסיטומטרי, כתמים נסרקו וכומתו באמצעות תוכנת BandScan והתוצאות הובעו כיחס בין אימוניות אימונטיביות של גן המטרה לפעילות חיסונית של טובולין.
חישובים סטטיסטיים בוצעו באמצעות חבילת התוכנה SPSS16.0 (SPSS, ארה"ב). נתונים שנאספו במהלך המחקר הובעו כסטיית תקן ממוצעת (ממוצע ± SD) ונותחו באמצעות ניתוח מדדים חוזרים חד-כיווניים של שונות (ANOVA) כדי לקבוע הבדלים בין שתי הקבוצות. P <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
לפיכך, הקמת מודל בעלי חיים של MC על ידי השתלת NPs אוטולוגיים בגוף החוליה וביצוע תצפית מאקרואנטומית, ניתוח MRI, הערכה היסטולוגית וניתוח ביולוגי מולקולרי עשוי להפוך לכלי חשוב להערכת והבנת המנגנונים של MC אנושי ופיתוח טיפולים חדשים. התערבויות.
כיצד לצטט מאמר זה: Han, C. et al. מודל בעלי חיים של שינויים במודיק הוקם על ידי השתלת גרעין pulposus אוטולוגי לתוך העצם התת-כונדרלית של עמוד השדרה המותני. Sci. רפ' 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. הדמיית תהודה מגנטית של עמוד השדרה המותני: שכיחות של פריצת דיסק ושימור, דחיסת שורש עצבים, הפרעות בלוחית הקצה ואוסטאוארתריטיס במפרק פן אצל מתנדבים אסימפטומטיים . קֶצֶב. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, and Leboeuf-Eed, K. Modic שינויים והקשר שלהם לממצאים קליניים. European Spine Journal: פרסום רשמי של ה-European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, והחברה האירופית לחקר עמוד השדרה הצווארי 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. שינויים מודיים בפלטות הקצה של החוליות המותניות: שכיחות וקשר עם כאבי גב תחתון וסכיאטיקה אצל עובדים גברים בגיל העמידה. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., and Dalinka, M. MRI של שינויים במח עצם ליד הצלחת הקצה במחלה ניוונית של עמוד השדרה המותני. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, and Carter, JR מחלת דיסק ניוונית: הערכה של שינויים במח החוליות עם MRI. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, and Carter, JR הדמיה של מחלת דיסק ניוונית. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. מנבאים של ה-neovertebral endplate (Modic) מאותתים על שינויים באוכלוסייה הכללית. European Spine Journal: Publication Official of the European Spine Society, the European Society of Spinal Deformity, and the European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB and Mannisch, K. Modic שינויים לאחר פריצת דיסק מותני. European Spine Journal : Publication Official of the European Spine Society, the European Society of Spinal Deformity and the European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. שינויים מסוג Modic I יכולים לחזות ניוון דיסק דפורמטיבי מתקדם במהירות: מחקר פרוספקטיבי בן שנה. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ ו- Fan, SW Modic שינויים: סיבות אפשריות ותרומה לניוון הדיסק המותני. השערות רפואיות 73, 930–932, דואי: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV פריצת דיסק פנימית. בעיות צניחת דיסק במשך 50 שנה. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
זמן פרסום: 13 בדצמבר 2024