גרעין פולפוסוס אוטולוגי מושתל בעצם תת-סחוסית מותנית ליצירת מודל חיה של שינויים במודיק

תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן חדש יותר (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
ביסוס מודלים של בעלי חיים של שינוי מודי (MC) הוא בסיס חשוב לחקר MC. חמישים וארבעה ארנבים לבנים מניו זילנד חולקו לקבוצת ניתוח דמה, קבוצת השתלת שריר (קבוצת ME) וקבוצת השתלת גרעין פולפוסוס (קבוצת NPE). בקבוצת ה-NPE, הדיסק הבין-חולייתי נחשף בגישה כירורגית מותנית קדמית, ונעשה שימוש במחט כדי לנקב את גוף החוליה L5 ליד לוחית הקצה. NP חולץ מהדיסק הבין-חולייתי L1/2 באמצעות מזרק והוזרק לתוכו. קידוח חור בעצם התת-סחוסית. ההליכים הכירורגיים ושיטות הקידוח בקבוצת השתלת השריר ובקבוצת ניתוח הדמה היו זהים לאלה בקבוצת השתלת NP. בקבוצת ה-ME, חתיכת שריר הוכנסה לחור, בעוד שבקבוצת ניתוח הדמה לא הוכנס דבר לחור. לאחר הניתוח בוצעו סריקת MRI ובדיקות ביולוגיות מולקולריות. האות בקבוצת ה-NPE השתנה, אך לא היה שינוי אות ברור בקבוצת ניתוח הדמה ובקבוצת ה-ME. תצפית היסטולוגית הראתה כי נצפתה התפשטות רקמות לא תקינה באתר ההשתלה, והביטוי של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ היה מוגבר בקבוצת ה-NPE. השתלת NP בעצם התת-סחוסית יכולה ליצור מודל חיה של MC.
שינויים מודיים (MC) הם נגעים של לוחות הקצה של החוליות ומח העצם הסמוך הנראים בהדמיית תהודה מגנטית (MRI). הם שכיחים למדי אצל אנשים עם תסמינים נלווים1. מחקרים רבים הדגישו את חשיבות MC בשל הקשר שלו לכאבי גב תחתון (LBP)2,3. דה רוס ועמיתיו4 ומודיק ועמיתיו5 תיארו באופן עצמאי לראשונה שלושה סוגים שונים של אנומליות אות תת-סחוסיות במח העצם של החוליות. שינויים מסוג I של מודיק הם היפוינטנס ברצפי T1-weighted (T1W) והיפר-אינטנס ברצפי T2-weighted (T2W). נגע זה חושף לוחות קצה של פיסורה ורקמת גרנולציה וסקולרית סמוכה במח העצם. שינויים מסוג II של מודיק מראים אות גבוה הן ברצפי T1W והן ברצפי T2W. בסוג זה של נגע, ניתן למצוא הרס של לוחות הקצה, כמו גם החלפה שומנית היסטולוגית של מח העצם הסמוך. שינויים מסוג III של מודיק מראים אות נמוך ברצפי T1W ו-T2W. נצפו נגעים סקלרוטיים התואמים ללוחות הקצה6. MC נחשבת למחלה פתולוגית של עמוד השדרה וקשורה קשר הדוק למחלות ניווניות רבות של עמוד השדרה7,8,9.
בהתחשב בנתונים הזמינים, מספר מחקרים סיפקו תובנות מפורטות לגבי האטיולוגיה והמנגנונים הפתולוגיים של קרע דיסק (MC). אלברט ועמיתיו הציעו כי MC עשוי להיגרם על ידי פריצת דיסק8. הו ועמיתיו ייחסו MC לניוון דיסק חמור10. קרוק הציעו את המושג "קרע דיסק פנימי", הקובע כי טראומה חוזרת ונשנית לדיסק עלולה להוביל לקרעים מיקרו-קרועים בקצה הלוחית. לאחר היווצרות שסוע, הרס לוחית הקצה על ידי הגרעין הפולפוסוס (NP) עלול לעורר תגובה אוטואימונית, מה שמוביל עוד יותר להתפתחות MC11. מא ועמיתיו חלקו דעה דומה ודיווחו כי אוטואימוניות הנגרמת על ידי NP ממלאת תפקיד מפתח בפתוגנזה של MC12.
תאי מערכת החיסון, ובמיוחד תאי לימפוציטים מסוג CD4+ T עוזרים, ממלאים תפקיד קריטי בפתוגנזה של אוטואימוניות13. תת-הקבוצה של תאי Th17 שהתגלתה לאחרונה מייצרת את הציטוקין הפרו-דלקתי IL-17, מקדמת ביטוי של כימוקינים ומגרה תאי T באיברים פגועים לייצר IFN-γ14. תאי Th2 ממלאים גם תפקיד ייחודי בפתוגנזה של תגובות חיסוניות. ביטוי של IL-4 כתא Th2 מייצג יכול להוביל לתוצאות אימונופתולוגיות חמורות15.
למרות שנערכו מחקרים קליניים רבים על MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, עדיין קיים מחסור במודלים ניסויים בבעלי חיים מתאימים שיכולים לחקות את תהליך MC המתרחש לעתים קרובות בבני אדם וניתן להשתמש בהם כדי לחקור את האטיולוגיה או טיפולים חדשים כגון טיפול ממוקד. עד כה, דווחו רק מספר קטן של מודלים בבעלי חיים של MC שחקרו את המנגנונים הפתולוגיים הבסיסיים.
בהתבסס על התיאוריה האוטואימונית שהוצעה על ידי אלברט ומא, מחקר זה ביסס מודל פשוט וניתן לשחזור של מחלת מוח ארנבת על ידי השתלת ננו-חלקיקים ליד לוחית הקצה של החוליה שנקדח. מטרות נוספות הן לבחון את המאפיינים ההיסטולוגיים של מודלים של בעלי חיים ולהעריך את המנגנונים הספציפיים של ננו-חלקיקים בהתפתחות מחלת מוח. לשם כך, אנו משתמשים בטכניקות כגון ביולוגיה מולקולרית, MRI ומחקרים היסטולוגיים כדי לחקור את התקדמות מחלת מוח.
שני ארנבים מתו מדימום במהלך הניתוח, וארבעה ארנבים מתו במהלך הרדמה במהלך MRI. 48 הארנבים הנותרים שרדו ולא הראו סימנים התנהגותיים או נוירולוגיים לאחר הניתוח.
MRI מראה שעוצמת האות של הרקמה המשובצת בחורים שונים שונה. עוצמת האות של גוף החוליה L5 בקבוצת ה-NPE השתנתה בהדרגה בשבועות 12, 16 ו-20 לאחר ההחדרה (רצף T1W הראה אות נמוך, ורצף T2W הראה אות מעורב בתוספת אות נמוך) (איור 1C), בעוד שמראה ה-MRI של שתי הקבוצות האחרות של החלקים המשובצים נותר יציב יחסית באותה תקופה (איור 1A, B).
(א) צילומי MRI עוקבים מייצגים של עמוד השדרה המותני של ארנבת ב-3 נקודות זמן. לא נמצאו חריגות אות בתמונות של קבוצת הניתוח המדומה. (ב) מאפייני האות של גוף החוליה בקבוצת ה-ME דומים לאלה של קבוצת הניתוח המדומה, ולא נצפה שינוי משמעותי באות באתר ההטמעה לאורך זמן. (ג) בקבוצת ה-NPE, האות הנמוך נראה בבירור ברצף T1W, והאות המעורב והאות הנמוך נראים בבירור ברצף T2W. מתקופה של 12 שבועות לתקופה של 20 שבועות, האותות הגבוהים הספורדיים המקיפים את האותות הנמוכים ברצף T2W פוחתים.
ניתן לראות היפרפלזיה ברורה של העצם באתר ההשרשה של גוף החוליה בקבוצת ה-NPE, והיפרפלזיה של העצם מתרחשת מהר יותר בין 12 ל-20 שבועות (איור 2C) בהשוואה לקבוצת ה-NPE, לא נצפה שינוי משמעותי בגופי החוליה שמודלנו; קבוצת הדמה וקבוצת ה-ME (איור 2C) 2A,B).
(א) פני השטח של גוף החוליה בחלק המושתל חלקים מאוד, החור מתרפא היטב, ואין היפרפלזיה בגוף החוליה. (ב) צורת האתר המושתל בקבוצת ה-ME דומה לזו שבקבוצת הניתוח המדומה, ואין שינוי ניכר במראה האתר המושתל לאורך זמן. (ג) היפרפלזיה של העצם התרחשה באתר המושתל בקבוצת ה-NPE. היפרפלזיה של העצם גדלה במהירות ואף התרחבה דרך הדיסק הבין-חולייתי לגוף החוליה הנגדי.
ניתוח היסטולוגי מספק מידע מפורט יותר על היווצרות העצם. איור 3 מציג את תצלומי החתכים שלאחר הניתוח שצובעו ב-H&E. בקבוצת הניתוח המדומה, הכונדרוציטים היו מסודרים היטב ולא זוהתה התפשטות תאים (איור 3A). המצב בקבוצת ה-ME היה דומה לזה שבקבוצת הניתוח המדומה (איור 3B). עם זאת, בקבוצת ה-NPE נצפה מספר רב של כונדרוציטים והתפשטות של תאים דמויי NP באתר ההשתלה (איור 3C);
(א) ניתן לראות טרבקולות ליד לוחית הקצה, הכונדרוציטים מסודרים בצורה מסודרת עם גודל וצורה אחידים של התאים וללא התרבות (פי 40). (ב) מצב אתר ההשתלה בקבוצת ה-ME דומה לזה של קבוצת הדמה. ניתן לראות טרבקולות וכונדרוציטים, אך אין התרבות ברורה באתר ההשתלה (פי 40). (ב) ניתן לראות שכונדרוציטים ותאים דמויי NP מתרבים באופן משמעותי, וצורת וגודל הכונדרוציטים אינם אחידים (פי 40).
ביטוי של mRNA של אינטרלוקין 4 (IL-4), mRNA של אינטרלוקין 17 (IL-17) ו-mRNA של אינטרפרון γ (IFN-γ) נצפה הן בקבוצת ה-NPE והן בקבוצת ה-ME. כאשר הושוו רמות הביטוי של גני המטרה, ביטויי הגנים של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ היו גבוהים משמעותית בקבוצת ה-NPE בהשוואה לאלו של קבוצת ה-ME וקבוצת הניתוח המדומה (איור 4) (P < 0.05). בהשוואה לקבוצת הניתוח המדומה, רמות הביטוי של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ בקבוצת ה-ME עלו רק במעט ולא הגיעו לשינוי סטטיסטי (P > 0.05).
ביטוי mRNA של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ בקבוצת ה-NPE הראה מגמה גבוהה משמעותית מאלה בקבוצת הניתוח המדומה ובקבוצת ה-ME (P < 0.05).
לעומת זאת, רמות הביטוי בקבוצת ME לא הראו הבדל משמעותי (P>0.05).
ניתוח Western blot בוצע באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית כנגד IL-4 ו-IL-17 כדי לאשר את דפוס ביטוי ה-mRNA המשתנה. כפי שמוצג באיורים 5A,B, בהשוואה לקבוצת ה-ME ולקבוצת הניתוח המדומה, רמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 בקבוצת ה-NPE היו גבוהות משמעותית (P < 0.05). בהשוואה לקבוצת הניתוח המדומה, גם רמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 בקבוצת ה-ME לא הצליחו להגיע לשינויים מובהקים סטטיסטית (P > 0.05).
(א) רמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 בקבוצת ה-NPE היו גבוהות משמעותית מאלה בקבוצת ה-ME ובקבוצת הפלצבו (P < 0.05). (ב) היסטוגרמה של Western blot.
בשל המספר המוגבל של דגימות אנושיות שהתקבלו במהלך הניתוח, מחקרים ברורים ומפורטים על הפתוגנזה של MC הינם קשים למדי. ניסינו ליצור מודל חיה של MC כדי לחקור את המנגנונים הפתולוגיים הפוטנציאליים שלו. במקביל, נעשה שימוש בהערכה רדיולוגית, הערכה היסטולוגית והערכה ביולוגית מולקולרית כדי לעקוב אחר מהלך MC המושרה על ידי אוטוגרפט NP. כתוצאה מכך, מודל השתלת NP הביא לשינוי הדרגתי בעוצמת האות מנקודות זמן של 12 שבועות לשבוע 20 (אות נמוך מעורב ברצפי T1W ואות נמוך ברצפי T2W), דבר המצביע על שינויים ברקמות, וההערכות ההיסטולוגיות והביולוגיות המולקולריות אישרו את תוצאות המחקר הרדיולוגי.
תוצאות ניסוי זה מראות כי התרחשו שינויים חזותיים והיסטולוגיים באתר הפגיעה בגוף החוליה בקבוצת ה-NPE. במקביל, נצפו ביטויים של גנים IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, כמו גם IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, דבר המצביע על כך שהפגיעה ברקמת גרעין פולפוסוס אוטולוגית בגוף החוליה עלולה לגרום לסדרה של שינויים איתות ומורפולוגיים. קל לגלות שמאפייני האות של גופי החוליה של המודל החייתי (אות נמוך ברצף T1W, אות מעורב ואות נמוך ברצף T2W) דומים מאוד לאלה של תאי חוליה אנושיים, ומאפייני ה-MRI מאשרים גם את התצפיות של היסטולוגיה ואנטומיה גסה, כלומר, השינויים בתאי גוף החוליה הם פרוגרסיביים. למרות שהתגובה הדלקתית הנגרמת מטראומה חריפה עשויה להופיע זמן קצר לאחר הדקירה, תוצאות ה-MRI הראו כי שינויי אות הולכים וגדלים הופיעו 12 שבועות לאחר הדקירה ונמשכו עד 20 שבועות ללא סימנים של התאוששות או היפוך של שינויי ה-MRI. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-NP ורטרלי אוטולוגי היא שיטה אמינה לקביעת MV מתקדם בארנבות.
מודל ניקוב זה דורש מיומנות, זמן ומאמץ כירורגי נאותים. בניסויים מקדימים, דיסקציה או גירוי מוגזם של המבנים הרצועות הפרה-ורטברליים עלולים לגרום להיווצרות אוסטאופיטים בחוליות. יש לנקוט משנה זהירות כדי לא לפגוע או לגרות את הדיסקים הסמוכים. מכיוון שיש לשלוט בעומק החדירה כדי לקבל תוצאות עקביות וניתנות לשחזור, יצרנו פקק ידנית על ידי חיתוך מעטפת מחט באורך 3 מ"מ. שימוש בפקק זה מבטיח עומק קידוח אחיד בגוף החוליה. בניסויים מקדימים, שלושה מנתחים אורתופדיים שהיו מעורבים בניתוח מצאו שקל יותר לעבוד עם מחטים בקוטר 16 מאשר מחטים בקוטר 18 או שיטות אחרות. כדי למנוע דימום מוגזם במהלך הקידוח, החזקת המחט במקום לזמן מה תספק חור החדרה מתאים יותר, דבר המצביע על כך שניתן לשלוט במידה מסוימת של חדירה דרך עצם (MC) בדרך זו.
למרות שמחקרים רבים התמקדו בתאי MC, מעט ידוע על האטיולוגיה והפתוגנזה של MC25,26,27. בהתבסס על מחקרים קודמים שערכנו, מצאנו כי אוטואימוניות ממלאת תפקיד מפתח בהופעה ובהתפתחות של MC12. מחקר זה בחן את הביטוי הכמותי של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, שהם מסלולי ההתמיינות העיקריים של תאי CD4+ לאחר גירוי אנטיגן. במחקר שלנו, בהשוואה לקבוצה השלילית, לקבוצת ה-NPE היה ביטוי גבוה יותר של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ, ורמות החלבון של IL-4 ו-IL-17 היו גם הן גבוהות יותר.
מבחינה קלינית, ביטוי mRNA של IL-17 מוגבר בתאי NP מחולים עם פריצת דיסק28. רמות ביטוי מוגברות של IL-4 ו-IFN-γ נמצאו גם במודל פריצת דיסק חריפה שאינה לוחצת בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה29. IL-17 ממלא תפקיד מפתח בדלקת, פגיעה ברקמות במחלות אוטואימוניות30 ומשפר את התגובה החיסונית ל-IFN-γ31. פגיעה מוגברת ברקמות בתיווך IL-17 דווחה בעכברי MRL/lpr32 ובעכברים רגישים לאוטואימוניות33. IL-4 יכול לעכב את הביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת (כגון IL-1β ו-TNFα) ואת הפעלת מקרופאגים34. דווח כי ביטוי mRNA של IL-4 היה שונה בקבוצת NPE בהשוואה ל-IL-17 ו-IFN-γ באותה נקודת זמן; ביטוי mRNA של IFN-γ בקבוצת NPE היה גבוה משמעותית מזה של הקבוצות האחרות. לכן, ייצור IFN-γ עשוי להיות מתווך של התגובה הדלקתית הנגרמת על ידי אינטרקלציה של NP. מחקרים הראו כי IFN-γ מיוצר על ידי מספר סוגי תאים, כולל תאי T מסייעים מסוג 1 מופעלים, תאי רוצח טבעיים ומקרופאגים35,36, והוא ציטוקין פרו-דלקתי מרכזי המקדם תגובות חיסוניות37.
מחקר זה מצביע על כך שתגובה אוטואימונית עשויה להיות מעורבת בהופעה ובהתפתחות של סרטן השדרה (MC). לואומה ועמיתיו מצאו שמאפייני האות של MC ושל ננו-חלקיקים בולטים דומים ב-MRI, ושניהם מראים אות גבוה ברצף T2W38. ציטוקינים מסוימים אושרו כקשורים קשר הדוק להופעת MC, כגון IL-139. מא ועמיתיו הציעו כי בליטה כלפי מעלה או מטה של ​​ננו-חלקיקים עשויה להשפיע רבות על הופעה והתפתחות של MC12. בובצ'קו40 והרצביין ועמיתיו41 דיווחו כי ננו-חלקיקים היא רקמה אימונו-סובלנית שאינה יכולה להיכנס למחזור הדם מלידה. בליטות ננו-חלקיקים מכניסות גופים זרים לאספקת הדם, ובכך מתווכות תגובות אוטואימוניות מקומיות42. תגובות אוטואימוניות יכולות לגרום למספר רב של גורמי חיסון, וכאשר גורמים אלה נחשפים באופן רציף לרקמות, הם יכולים לגרום לשינויים באיתות43. במחקר זה, ביטוי יתר של IL-4, IL-17 ו-IFN-γ הם גורמי חיסון אופייניים, מה שמוכיח עוד יותר את הקשר ההדוק בין ננו-חלקיקים לננו-חלקיקים44. מודל חיה זה מחקה היטב את פריצת הננו-חלקיקים ואת כניסתם ללוחית הקצה. תהליך זה חשף עוד יותר את השפעת האוטואימוניות על MC.
כצפוי, מודל חיה זה מספק לנו פלטפורמה אפשרית לחקר MC. עם זאת, למודל זה עדיין יש כמה מגבלות: ראשית, במהלך שלב התצפית בבעלי חיים, יש צורך להרדים חלק מהארנבים בשלב הביניים לצורך בדיקות ביולוגיה היסטולוגית ומולקולרית, כך שחלק מהחיות "יוצאות משימוש" עם הזמן. שנית, למרות שנקבעו שלוש נקודות זמן במחקר זה, למרבה הצער, מודלנו רק סוג אחד של MC (שינוי מסוג Modic I), כך שזה לא מספיק כדי לייצג את תהליך התפתחות המחלה האנושית, ויש לקבוע נקודות זמן נוספות כדי לצפות טוב יותר בכל שינויי האות. שלישית, אכן ניתן להראות בבירור את השינויים במבנה הרקמה על ידי צביעה היסטולוגית, אך טכניקות מיוחדות מסוימות יכולות לחשוף טוב יותר את השינויים המיקרו-מבניים במודל זה. לדוגמה, מיקרוסקופיית אור מקוטב שימשה לניתוח היווצרות סחוס פיברומי בדיסקים בין-חולייתיים של ארנבות. ההשפעות ארוכות הטווח של NP על MC ועל לוחית הקצה דורשות מחקר נוסף.
חמישים וארבעה ארנבים לבנים ניו זילנדיים זכרים (משקל כ-2.5-3 ק"ג, גיל 3-3.5 חודשים) חולקו באופן אקראי לקבוצת ניתוח דמה, קבוצת השתלת שריר (קבוצת ME) וקבוצת השתלת שורש עצב (קבוצת NPE). כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים טיינג'ין, ושיטות הניסוי בוצעו בהתאם קפדנית להנחיות שאושרו.
שיפורים מסוימים בוצעו בטכניקת הניתוח של S. Sobajima 46. כל ארנבת הונחה בשכיבה צידית ונחשף המשטח הקדמי של חמישה דיסקים בין-חולייתיים (IVD) מותניים רצופים באמצעות גישה רטרופריטונאלית פוסטרולטרלית. כל ארנבת קיבלה הרדמה כללית (20% אוריתן, 5 מ"ל/ק"ג דרך וריד האוזן). בוצע חתך עור אורכי מהקצה התחתון של הצלעות ועד שפת האגן, 2 ס"מ מהגחון לשרירים הפרה-ורטברליים. עמוד השדרה הקדמי-צדדי הימני מ-L1 עד L6 נחשף באמצעות דיסקציה חדה ובוטה של ​​הרקמה התת-עורית שמעליה, הרקמה הרטרופריטונאלית והשרירים (איור 6A). גובה הדיסק נקבע באמצעות שפת האגן כנקודת ציון אנטומית לגובה הדיסק L5-L6. השתמשו במחט ניקוב 16-gaug כדי לקדוח חור ליד לוחית הקצה של חוליה L5 לעומק של 3 מ"מ (איור 6B). השתמשו במזרק של 5 מ"ל כדי לשאוב את גרעין הפולפוסוס האוטולוגי מהדיסק הבין-חולייתי L1-L2 (איור 6C). הסירו את גרעין הפולפוסוס או את השריר בהתאם לדרישות של כל קבוצה. לאחר העמקת חור הקידוח, מניחים תפרים נספגים על הפאשיה העמוקה, הפאשיה השטחית והעור, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה הפריאוסטלית של גוף החוליה במהלך הניתוח.
(א) דיסק L5-L6 נחשף באמצעות גישה רטרופריטונאלית פוסטרולטרלית. (ב) השתמשו במחט 16-gaug כדי לקדוח חור ליד לוחית הקצה של L5. (ג) נאספים MFs אוטולוגיים.
בוצעה הרדמה כללית עם 20% אוריטן (5 מ"ל/ק"ג) דרך וריד האוזן, וצילומי רנטגן של עמוד השדרה המותני בוצעו שוב 12, 16 ו-20 שבועות לאחר הניתוח.
ארנבות הוקרבו באמצעות הזרקה תוך שרירית של קטמין (25.0 מ"ג/ק"ג) ונתרן פנטוברביטל תוך ורידי (1.2 גרם/ק"ג) בשבועות 12, 16 ו-20 לאחר הניתוח. עמוד השדרה כולו הוסר לצורך ניתוח היסטולוגי ובוצע ניתוח אמיתי. תעתוק הפוך כמותי (RT-qPCR) ו-Western blotting שימשו לזיהוי שינויים בגורמי חיסון.
בדיקות MRI בוצעו בארנבות באמצעות מגנט קליני 3.0 T (GE Medical Systems, פירנצה, דרום קרוליינה) המצויד במקלט סליל גפיים אורתוגונלי. הארנבות הורדו עם 20% אוריתן (5 מ"ל/ק"ג) דרך וריד האוזן ולאחר מכן הונחו על הגב בתוך המגנט כאשר אזור המותני ממורכז על סליל משטח עגול בקוטר 5 אינץ' (GE Medical Systems). תמונות לוקליזטור משוקללות T2 קורונליות (TR, 1445 אלפיות שנייה; TE, 37 אלפיות שנייה) נרכשו כדי להגדיר את מיקום הדיסק המותני מ-L3-L4 ל-L5-L6. פרוסות משוקללות T2 במישור הסגיטלי נרכשו עם ההגדרות הבאות: רצף ספין-הד מהיר עם זמן חזרה (TR) של 2200 אלפיות שנייה וזמן הד (TE) של 70 אלפיות שנייה, מטריצה; שדה ראייה של 260 ושמונה גירויים; עובי החיתוך היה 2 מ"מ, הרווח היה 0.2 מ"מ.
לאחר שצולמה התמונה האחרונה והארנבת האחרונה הומתה, הוצאו הדיסקים המדומה, הדיסקים המשובצים בשריר ודיסקים NP לבדיקה היסטולוגית. הרקמות קובעו בפורמלין ניטרלי 10% למשך שבוע אחד, סולקו באמצעות חומצה אתילן-דיאמין-טטרא-אצטית ונחתכו בפרפין. בלוקי רקמה הוטמעו בפרפין ונחתכו לחתכים סגיטליים (עובי 5 מיקרון) באמצעות מיקרוטום. החתכים נצבעו בהמטוקסילין ואאוזין (H&E).
לאחר איסוף הדיסקים הבין-חולייתיים מהארנבים בכל קבוצה, חולץ RNA כולל באמצעות עמודה UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., סין) בהתאם להוראות היצרן ומערכת שעתוק הפוך ImProm II (Promega Inc., מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב). בוצע שעתוק הפוך.
RT-qPCR בוצע באמצעות Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ארה"ב) ו-SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) בהתאם להוראות היצרן. נפח תגובת ה-PCR היה 20 מיקרוליטר והכיל 1.5 מיקרוליטר של cDNA מדולל ו-0.2 מיקרומולר מכל פריימר. הפריימרים עוצבו על ידי OligoPerfect Designer (Invitrogen, ולנסיה, קליפורניה) ויוצרו על ידי Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (סין) (טבלה 1). נעשה שימוש בתנאי המחזור התרמי הבאים: שלב הפעלת פולימראז ראשוני ב-94°C למשך 2 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של 15 שניות כל אחד ב-94°C לצורך דנטורציה של התבנית, חישול למשך דקה אחת ב-60°C, הארכה ופלואורסצנציה. המדידות בוצעו למשך דקה אחת ב-72°C. כל הדגימות הוגברו שלוש פעמים והערך הממוצע שימש לניתוח RT-qPCR. נתוני הגברה נותחו באמצעות FlexStation 3 (Molecular Devices, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב). ביטוי הגנים IL-4, IL-17 ו-IFN-γ מנורמל לבקרה האנדוגנית (ACTB). רמות הביטוי היחסיות של mRNA המטרה חושבו באמצעות שיטת 2-ΔΔCT.
חלבון כולל חולץ מהרקמות באמצעות הומוגנייזר רקמות בבופר ליזיס RIPA (המכיל קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז) ולאחר מכן נצנטריפוגה ב-13,000 סל"ד למשך 20 דקות ב-4°C כדי להסיר שאריות רקמה. חמישים מיקרוגרם של חלבון הועמסו לכל נתיב, הופרדו באמצעות 10% SDS-PAGE, ולאחר מכן הועברו לממברנת PVDF. החסימה בוצעה בחלב יבש ללא שומן 5% בתמיסת מלח בופר Tris (TBS) המכילה 0.1% Tween 20 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הממברנה הודגרה עם נוגדן ראשוני אנטי-דקורין ארנבת (מדולל 1:200; בוסטר, ווהאן, סין) (מדולל 1:200; ביוס, בייג'ינג, סין) למשך הלילה ב-4°C והגיבה בימים השניים; עם נוגדן משני (אימונוגלובולין G של עז נגד ארנבת בדילול 1:40,000) בשילוב עם פרוקסידאז חזרת (בוסטר, ווהאן, סין) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אותות כתם מערבי זוהו על ידי כימילומינסנציה מוגברת על הממברנה הכימילומינסנטית לאחר הקרנת רנטגן. לצורך ניתוח דנסיטומטרי, נסרקו וכימותו הכתמים באמצעות תוכנת BandScan והתוצאות באו לידי ביטוי כיחס בין אימונו-ריאקטיביות של גן המטרה לאימונולוגיות של טובולין.
חישובים סטטיסטיים בוצעו באמצעות חבילת התוכנה SPSS16.0 (SPSS, ארה"ב). הנתונים שנאספו במהלך המחקר באו לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן (ממוצע ± סטיית תקן) ונותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני של מדידות חוזרות (ANOVA) כדי לקבוע הבדלים בין שתי הקבוצות. P < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.
לפיכך, הקמת מודל חיה של MC על ידי השתלת ננו-חלקיקים אוטולוגיים בגוף החוליה וביצוע תצפיות מקרואנטומיות, ניתוח MRI, הערכה היסטולוגית וניתוח ביולוגי מולקולרי עשויה להפוך לכלי חשוב להערכת והבנת המנגנונים של MC אנושי ולפיתוח התערבויות טיפוליות חדשות.
כיצד לצטט מאמר זה: Han, C. et al. מודל חיה של שינויים מודיים נוצר על ידי השתלת גרעין פולפוסוס אוטולוגי בעצם התת-סובכונדרלית של עמוד השדרה המותני. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. דימות תהודה מגנטית של עמוד השדרה המותני: שכיחות פריצת דיסק ועצירות, דחיסת שורש עצב, אנומליות בצלחת הקצה, ואוסטאוארתריטיס במפרק הפאזה אצל מתנדבים אסימפטומטיים. rate. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
קייר, פ., קורסולם, ל., בנדיקס, ט., סורנסן, ג'.ס., ולבווף-אד, ק. שינויים במודיק והקשר שלהם לממצאים קליניים. כתב העת האירופי לעמוד שדרה: פרסום רשמי של האגודה האירופית לעמוד שדרה, האגודה האירופית לעיוותים בעמוד השדרה, והאגודה האירופית לחקר עמוד שדרה צווארי 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. שינויים מודיים בקצה החוליות המותניות: שכיחות וקשר עם כאבי גב תחתון וסיאטיקה בקרב עובדים גברים בגיל העמידה. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
דה רוס, א., קרסל, ה., שפריצר, ק., ודאלינקה, מ. MRI של שינויים במח העצם ליד לוחית הקצה במחלה ניוונית של עמוד השדרה המותני. AJR. כתב העת האמריקאי לרדיולוגיה 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
מודיק, מ.ט., שטיינברג, פ.מ., רוס, ג'.ס., מסריק, ט.ג'., וקרטר, ג'.ר. מחלת דיסק ניוונית: הערכת שינויים במח החוליה באמצעות MRI. רדיולוגיה 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
מודיק, מ.ט., מסריק, ט.ג'., רוס, ג'.ס., וקרטר, ג'.ר. הדמיה של מחלת דיסק ניוונית. רדיולוגיה 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
ג'נסן, ט.ס. ואחרים. גורמים מנבאים של לוחית קצה חדשה של חוליות (Modic) מאותתים על שינויים באוכלוסייה הכללית. כתב העת האירופי לעמוד שדרה: פרסום רשמי של האגודה האירופית לעמוד שדרה, האגודה האירופית לעיוותים בעמוד השדרה והאגודה האירופית לחקר עמוד שדרה צווארי, חטיבה 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
אלברט, ה.ב. ומניש, ק. שינויים במודיק לאחר פריצת דיסק בגב התחתון. כתב העת האירופי לעמוד שדרה: פרסום רשמי של האגודה האירופית לעמוד שדרה, האגודה האירופית לעיוותים בעמוד השדרה והאגודה האירופית לחקר עמוד שדרה צווארי 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. שינויים מסוג I במודיק יכולים לחזות ניוון דיסק דפורמטיבי מתקדם במהירות: מחקר פרוספקטיבי בן שנה. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ and Fan, SW שינויים במודיק: גורמים אפשריים ותרומה לניוון דיסק מותני. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
קרוק, HV קרע דיסק פנימי. בעיות צניחת דיסק מעל 50 שנה. עמוד שדרה (פילה, PA 1976) 11, 650–653 (1986).